Simple Sequence Repeat（SSR，简单重复序列）标记由于具有重复性好、多态性高、呈共显性遗传、数量丰富和遍布整个基因组等优点而成为近年来使用最广泛的分子标记之一。传统的SSR标记的开发方法费时费力而且效率低。随着功能基因组学的发展，产生了大量的EST（Expressed Sequence Tag，表达序列标签）序列。应用EST序列开发的SSR引物在相关物种之间具有很高的可转移性，开发过程简单、成本低，成为现今最为流行的SSR引物开发方法。柿科Ebenaceae柿属Diospyros L.植物为我国重要的经济林资源。常见的柿属植物包括柿（D. kaki）、油柿（D. oleifera）和君迁子（D. lotus）等，其果实及其具有药用价值的成分广泛用于食品、制药和工业等多种行业，具有良好的生态效益和经济效益，是山区脱贫致富的重要树种。但柿属植物品种间的亲缘关系尚未有系统的分析，亲缘关系不甚明了；同时在长期栽培过程中分化出了许多宝贵资源，其遗传多样性和经济性状也有待深入开展研究与评价。因此开发特异的分子标记，是柿属育种及遗传多样性研究重要的辅助手段。本文利用从NCBI上获得的9474条柿属EST序列，开发EST-SSR引物。下载初始的EST序列经去除低质量及冗余片段后拼接成1390条重叠序列和4097条无重复序列。共搜索到601条EST序列中含有540个SSR。SSR出现频率为10.96%，其中以2核苷酸为主（61.06%）。3核苷酸和4核苷酸的出现频率分别为32.61%和6.33%。利用检出的SSR-ESTs序列共设计出合格的SSR引物158对，并对引物进行在线blast检测，去除3对无法检出来源的引物。从剩余的155对引物中选择得分较高的前100对引物进行合成。为检测设计的引物的多态性，首先应用‘罗田甜柿’等6个柿样品进行了PCR扩增，得到31对引物有扩增带，占设计引物的31%，其中14对引物有多态性，占可扩增引物的45.2%。同时发现，引物的SSR来自二重复基元序列的EST-SSR引物多态性最高（64.3%），SSR长度大于20bp之间的的EST序列的引物有较高的多态性（64.3%）。然后应用同样的引物，对9个柿属种间样品进行了PCR扩增，42对引物有扩增带，占设计引物的42%，其中30对引物有多态性，占可扩增引物的71.4%。30对引物中来自二重复基元序列的EST-SSR引物多态性最高（56.7%），SSR长度介于14bp和20bp之间的的EST序列的引物有较高的多态性（56.7%）。通过柿树和柿属两个水平的验证，最终发现35对引物有多态性，其中种内和种间通用的引物9对，仅可用于种内品种鉴定的引物5对，仅可用于柿属种间鉴定的引物21对。多态性分析结果表明，来自二重复基元序列的EST-SSR引物多态性最高（60%），其次是来自三重复基元的引物（37.1%），来自四重复基元的引物中仅有2对，为5.7%。设计引物的SSR长度介于14bp到45bp之间，且SSR长度介于14bp和20bp之间的的EST序列的引物有较高的多态性（54.3%），略高于SSR长度大于20bp的EST序列设计的引物（45.7%）。