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目的:1.研究碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌(carbapenemase resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae,CR-hvKP)的临床分布、耐药现状、流行病学特征及感染相关的危险因素;2.对比分析CR-hvKP菌株、碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(carbapenemase resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP)的耐药机制及毒力特点,分析可能的进化机制;3.分析CR-hvKP菌株与CRKP菌株对抗中性粒细胞吞噬能力的差异,初步探讨CR-hvKP菌株的致病机制。方法:1.收集2018年1月01日至2018年12月31日徐州医科大学附属医院临床首次分离的肺炎克雷伯菌株,并分析相关临床资料、危险因素等。所有分离的肺炎克雷伯菌均应用基质辅助激光解吸电离-飞行时间(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS),微生物质谱鉴定仪进行鉴定确证,通过拉丝试验及毒力基因检测筛选出高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP)。应用琼脂倍比稀释法检测hvKP菌株对常用抗菌药物的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),WHONET5.6软件分析MIC数据并筛选出其中的CR-hvKP菌株;2.PCR方法扩增相关耐药基因:碳青霉烯类耐药基因(blaKPC、blaSME、blaGES、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48)、超广谱β内酰胺酶(blaSHV、blaTEM、blaCTX-M-1 group、blaCTXM-2 group、blaCTX-M-8group、blaCTX-M-9 group)。采用 PFGE 及 MLST分析菌株的同源性,预测CR-hvKP菌株在医院内的流行状况,采用质粒接合试验确认碳青霉烯耐药质粒传播能力;3.PCR方法检测常见的荚膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54、K57)和毒力基因(rmpA、kfu、aerobactin、iroN、entB、ybtS、fimH、mrkD、allS、rmpA2、iucA),S1-PFGE联合Southern blot杂交技术分析CR-hvKP菌株毒力质粒特征。4.通过抗中性粒细胞吞噬试验来检测CR-hvKP菌株和CRKP菌株之间的差异,初步探讨CR-hvKP菌株致病机制。结果:1.本研究共收集了 1053例未重复的肺炎克雷伯菌,包括409株CRKP菌株(38.8%,409/1053),189 株 hvKP 菌株(17.9%,189/1053),26 株 CR-hvKP菌株(2.5%,26/1053),429菌株其他类型肺炎克雷伯菌(40.7%,429/1053)。26株CR-hvKP菌株均为多重耐药菌,对β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类抗菌药物均表现为100%耐药,对四环素耐药率为69.2%,没有发现CR-hvKP菌株对替加环素和多粘菌素耐药。2.从成年人中分离出的25株CR-hvKP菌株(96.2%,25/26)携带blaKPC-2,但从新生儿中分离出的一株菌株(3.8%,1/26)被检测出携带blaNDM-5。所有26株CR-hvKP均为blaTEM-1阳性,23株为blaSHV-11阳性,有3株为blaSHV-31阳性。14株分离株携带blaCTX-M-65,2株分离株携带blaCTX-M-14。在26株CR-hvKP菌株中共鉴定出5个ST分型。其中ST11型是最主要的ST型(87.5%,21/26),其次是 ST 37(7.7%,2/26),ST337(3.9%,1/26),ST23(3.9%,1/26)和 ST218(3.9%,1/26)。PFGE结果显示,将26株CR-hvKP菌株分为7个不同的PFGE簇群。簇群A和C为主要的簇群,分别占分离株的19.2%(5/26)和53.8%(14/26)。详细的流行病学调查发现,在某重症监护室病房中5位患者中分离出了 7个属于簇群 C 的 ST11 分离株(KP 15,KP 16,KP 16,KP 17,KP 18,KP19,KP20菌株),这表明这些菌株高度同源。进一步的调查发现在同一时期内,从该监护病房的5例患者中分离出7株CR-hvKP菌株,它们具有相同的耐药表型、碳青霉烯耐药基因、MLST分型和PFGE图谱,这表明在这个病区局部暴发了CR-hvKP菌株感染。我们针对这一暴发进行了流行病学调查,五名患者均患有严重的基础疾病,都接受了脑部手术,随后进行了抗菌治疗和机械通气,都出现了严重的呼吸机相关性肺炎。从5名患者的痰液或血液样本中均分离出了 CR-hvKP菌株。尽管五人均获得了针对性的抗菌治疗和严格的感染控制措施,但他们还是不幸死亡。3.在26株CR-hvKP菌株中,所有菌株均具有高黏表型,荚膜血清型K1有3株占11.5%,K2型有4株占15.4%,其余属于未分型的菌株有21株(73.1%)。大部分常见毒力基因携带率均超过50%,其中entB(100%,26/26)、aerobactin(92.3%,24/26)、mrkD(92.3%,24/26)、fimH(88.5%,23/26)、rmpA(84.5%,22/26)、iroN(80.7%,21/26)和ybtS(65.4%,17/26),通常位于毒力质粒上的毒力基因均具有很高的携带率,如iucA(100%,26/26)、rmpA(73.1%,19/26)、rmpA2(84.6%,22/26)、iroN(80.7%,21/26)。挑取 5 株代表性的 CR-hvKP 菌株对携带rpmA的质粒分析。S1-PFGE和Southern印迹证实了 4个菌株中大约存在219 Kb毒力质粒。除～219 kb质粒外,KP15分离株至少包含3个质粒,其质粒大小分别为～88 Kb,～80 Kb和～50 Kb,KP18分离株具有大约130 Kb的毒力质粒。4.CR-hvKP组和CRKP组对中性粒细胞呈现了不同程度的抗吞噬能力,CR-hvKP菌株组中性粒细胞的吞噬率显著低于CRKP菌株组(p<0.01)。结论:1.临床分布上CRKP菌株占绝对优势,仍然是临床抗感染治疗的最大挑战;CR-hvKP菌株在耐药率上与CRKP菌株具有相似性,对常用抗菌药物均高水平耐药,与hvKP菌株具有较大差异,hvKP菌株对大部分抗菌药物均保持高度敏感;同经典的CRKP菌株相似,高龄、严重的基础疾病、各种侵袭性操作和抗药物使用史是CR-hvKP菌株感染的高危因素。2.本地区流行的CR-hvKP菌株多是ST11型由质粒介导的产KPC-2酶的CRKP菌株,耐药机制与CRKP菌株高度相似,具有高传播能力,并且存在CRhvKP菌株的局部暴发流行,因当实施一种有效的防控手段降低这类细菌的流行。3.本地区的CR-hvKP菌株极有可能是由于生产ST11 KPC-2的经典CRKP菌株获得了毒性质粒(如pLVPK)进化而来,具有了高毒力特征。4.本地区分离的CR-hvKP菌株大部分含有丰富的荚膜多糖、携带大量的毒力基因和具有较强的抗中性粒吞噬能力,这些导致CR-hvKP菌株具有比经典的肺炎克雷伯菌更强的致病能力。意义:本研究以“超级细菌”CR-hvKP为研究对象,调查了该类肺炎克雷伯菌在临床的分布、耐药特点、危险因素等流行病学特点,使用分子生物学方法揭示了 CR-hvKP的耐药机制和毒力因素,为临床和医院感染控制部门治疗和预防此类细菌在医院内的传播提供了实验室数据支持。