论文部分内容阅读
背景免疫性血小板减少症(ITP)由自身免疫机制介导,是血液系统常见的出血性疾病。多数患者体内可以检测到抗血小板膜糖蛋白(GP)的自身抗体,导致血小板破坏加速和/或巨核细胞生成血小板功能障碍。B细胞由于其分泌抗体的特性,长期以来在ITP中一直被认为是重要的致病性因素。但近年来的研究表明,B细胞中存在着部分亚群可以负向调节免疫反应,称为调节性B细胞(Bregs),主要通过分泌IL-10发挥免疫调节效应。CD5是Bregs的重要表面标志之一,CD5+B细胞可以产生大量IL-10,因此CD5+B细胞在ITP免疫失衡机制及疾病发生发展中的作用不容忽视。大剂量地塞米松(HD-DXM)作为ITP治疗的一线方案之一,广泛作用于多种免疫细胞,如纠正Th1/Th2失衡、抑制树突状细胞成熟、减少促炎性细胞因子合成等,但其如何影响Bregs尤其是CD5+B细胞的免疫调节功能尚未阐明。目的 首先通过研究ITP患者外周血CD5+B细胞产生及分泌IL-10能力、对效应性T细胞的增殖、凋亡及Th1/Th2平衡的调控作用等,阐明ITP患者CD5+B细胞的免疫调节功能缺陷；然后比较HD-DXM治疗前后ITP患者CD5+B细胞上述功能的变化,揭示HD-DXM改善CD5+B细胞免疫调节功能的作用,从而帮助我们认识CD5+B细胞在ITP发病机制中的作用,并进一步从B细胞免疫调节功能角度加深对HD-DXM作用机制的理解；最后在TLRs信号传导通路中初步鉴定出可能导致ITP患者CD5+B细胞免疫调节功能障碍的分子缺陷。方法 (一)采集符合纳入标准的初发ITP患者接受HD-DXM治疗前后及健康志愿者静脉血各2mL, Ficoll密度梯度离心法分离外周血单形核细胞(PBMCs);PE-CD5/FITC-CD19流式抗体标记,流式细胞术检测CD5+CD19+B细胞的数量；在佛波酯(PMA)、离子霉素及布雷菲尔德菌素A(BFA)刺激条件下体外培养24小时后收获细胞,表面标记PE-CD5/FITC-CD19,固定、破膜后标记APC-IL-10,流式细胞术检测各细胞亚群胞内IL-10平均荧光强度及IL-10+细胞比例：留取部分标本以荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测IL-10 mRNA表达；酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆和培养上清液IL-10浓度。(二)采集符合纳入标准的初发ITP患者接受HD-DXM治疗前后及健康志愿者静脉血各20mL,分离PBMCs,免疫磁珠方法分别纯化出CD5+CD19+B细胞、CD5-CD 19+B细胞和CD4+T细胞,CFSE标记CD4+T细胞,接种于预包被CD3 mAb和CD28 mAb的96孔培养板,以不同梯度比例与CD5+CD19+B细胞或CD5-D19+B细胞共培养3-6天后,流式细胞术检测CD4+T细胞增殖状态；细胞标记PI/Annexin-V以检测其凋亡状态；细胞培养上清液以ELISA方法检测IL-4及IFN-y的浓度；RT-PCR法检测T-bet和GATA-3 mRNA的表达。(三)采集初发ITP患者及健康志愿者静脉血各20mL,分离PBMCs,免疫磁珠方法分别纯化出CD5+CD19+B细胞,运用PCR Array的方法,分析ITP患者CD5+B细胞中TLRs及其下游信号传导通路异常表达的分子。结果(一)ITP患者外周血CD5+B细胞占淋巴细胞的比例及绝对值计数均显著高于正常人,而且胞内IL-10染色表明ITP患者CD5+B细胞表达更高的IL-10平均荧光强度；RT-PCR结果提示ITP患者IL-10mRNA表达亦高于正常对照。但在体外培养上清液中,ITP患者的IL-10浓度明显低于正常对照。在经过HD-DXM有效治疗的患者,外周血CD5+B细胞数量恢复正常,其胞内IL-10表达进一步加强,IL-10 mRNA仍维持在较高水平,而培养上清液中IL-10的浓度则与正常相当。(二)当CD5+B细胞与CD4+T细胞共培养时,正常对照来源的CD5+B细胞可以抑制CD4+T细胞的增殖,并呈现剂量依赖效应。同时,CD5+B可促进CD4+T细胞的凋亡。与此相反,CD5-B细胞并不能抑制CD4+T细胞增殖,反而在体外培养72小时后,CD4+T细胞的增殖轻度增加,但这种差异尚不具有统计学意义。CD5-B细胞对CD4+T细胞的凋亡无明显影响。在ITP患者中,CD5+B细胞的免疫调节功能明显受损。CD5+B细胞与CD4+细胞的比例增加至3：1时方才显现出对CD4+T细胞增殖的抑制作用。1TP患者CD5+B细胞促进CD4+T细胞凋亡的能力亦存在缺陷。接受HD-DXM治疗后,CD5+B细胞抑制CD4+T细胞增殖的能力增强,促进凋亡的能力也可恢复至与正常相当。在健康对照中,在B：T细胞的比例仅为1：5时,CD5+B细胞即可明显抑制CD4+T分泌IFN-γ。ITP患者的CD5+B细胞抑制IFN-γ分泌的能力明显受损：只有当B/T比例升至1：1时,IFN-y的分泌才有所下降；而且,即使在B/T比例达到5：1时,ITP患者的CD4+T细胞仍可保留大约30%的IFN-y分泌。CD5+B细胞对IL-4的分泌无明显影响。接受HD-DXM治疗后,CD5+B细胞抑制IFN-y分泌的的能力得到部分恢复,但未能达到正常水平。(三)共有20个TLRs信号通路相关分子在ITP和正常对照之间表达明显相异。在ITP组中高表达的分子有12个,分别为CLEC4E、FOS、IL1B、IL6、IL8、IRAKI、 JUN、PTGS2、SIGI、TICAM2、TLR2和TNF。低表达的为8个,分别为CSF2、 CSF3、IFNB1、IRF3、TLR10、TLR3、TLR7和TLR9。结论ITP患者外周血CD5+B细胞数量增多,其胞内可产生大量IL-10,由于IL-10分泌障碍导致IL-10积聚于胞内,进而影响CD5+B细胞抑制T细胞增殖和纠正Th1/Th2失衡的能力；经HD-DXM有效治疗后,CD5+B细胞数量和功能均可恢复至正常,抑制CD4+T细胞增殖的能力均可恢复,但其抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ的功能则仅部分恢复。TLRs信号通路相关分子表达异常可能是导致ITP患者CD5+B细胞数量和功能异常的潜在机制。