研究背景：目前，对由各种原因所致骨骼肌缺损多采用肌瓣或者肌皮瓣移植治疗。临床效果虽然理想，但是由于此种治疗不可避免的将带来供区新的缺损，故科学家们一直在不懈努力以寻求新的治疗手段。随着组织工程学的飞速发展，越来越多的人们致力于组织工程化骨骼肌的构建，希望借此解决上述难题。 本课题的宗旨，是寻求一种可行的方法，以体外构建具有良好方向性的组织工程化大鼠骨骼肌纤维，为最终构建适宜临床应用的组织工程化骨骼肌打下坚实基础。 第一部份：离心作用检测细胞与材料间黏附力及其初步应用 目的：介绍一种简单易行的检测细胞与材料间黏附力的方法。 方法：本方法的建立基于离心力在转速一定时与半径成正比的原理。医用石膏制备培养皿固定装置，于培养皿底制备材料薄膜(包括有PLGA,PLGA+COL I,PLGA+COL I+FN)，待大鼠骨骼肌卫星细胞悬液与其作用一定时间后，一定转速开动离心机。测定未脱落细胞斑的半径R，取均值。 结果：上述三种材料表面未脱落大鼠骨骼肌卫星细胞圆斑半径(R)分别为7.96mm、15.11mm、26.10mm，三组间有显著性差异(P均小于0.001)。 结论：1) R的变化可反映细胞与材料间粘附力的改变。2)利用离心作用检测细胞与材料间的黏附力是可行的，尤其适用于同一种细胞与不同材料间黏附力的比较。3) COL I和FN的使用可以增加大鼠骨骼肌卫星细胞与PLGA间的黏附。第一军医大学博士学位论文 第二部分:动态张应变下大鼠骨骼肌卫星细胞的三维培养 目的:探讨借助动态张应变三维培养条件下，体外构建具有良好方向性组织工程化大鼠骨骼肌纤维的可能性。 方法:聚乙烯醇缩甲醛微孔材料裱衬PLGA为支架材料，复合大鼠骨骼肌卫星细胞。借助智能化张应变细胞培养系统，对大鼠骨骼肌卫星细胞一支架材料复合物施加牵张应变(10%应变、频率0.2Hz，每小时加载10而n，共作用48hr)。扫描电镜观察大鼠骨骼肌卫星细胞形态学变化以及排列情况，细胞计数以及通过检测磷酸肌酸激酶(CPK)研究动态张应变对细胞增殖与分化的影响。分别利用半定量Rr.PCR和EUSA技术从mRNA以及蛋白水平，探讨动态张应变对大鼠骨骼肌卫星细胞功能蛋白(aiPha一肌动蛋白与肌球蛋白)的影响。 结果:1)在动态张应变的作用下，骨骼肌卫星细胞沿应力方向延伸，并见到肌小管形成。而未施加应力的骨骼肌卫星细胞在各个方向上都有突起，未见到肌小管形成。而且动态张应变可以促进细胞增殖与分化(细胞数增加了14.6%，CPK值增加了32%)(P均小于0.001)。2)在受到动态张应变刺激后，大鼠骨骼肌卫星细胞aiPha一肌动蛋白对185 RNA的灰度比值，由0.45升高至0.54;肌球蛋白对185 RNA的灰度比值由1.65升至2.21。ELISA结果也显示:动态张应变使得骨骼肌aiPha一肌动蛋白的合成增加了24%，肌球蛋白合成增加了34%。 结论:动态张应变，可以刺激大鼠骨骼肌卫星细胞的增殖分化以及功能蛋白的表达与合成。而且，动态性张应变有利于肌纤维理想极性的形成，从而有助于组织工程化骨骼肌的构建。 第三部分:大鼠成肌细胞与具有平行结构支架材料的体外复合培养 目的:探讨借助将支架材料制备成平行状结构，复合大鼠成肌细胞后，体外构建具有良好方向性组织工程化大鼠骨骼肌肌纤维的可能性。 方法:首先将医用可吸收缝合线平行排列并制备成圆柱状，与大鼠成肌细胞株L6体外复合培养。借助倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞的形态学变化以及排列情况。MTT法检测体外培养早期细胞增殖，磷酸肌酸激酶(CPK)检测细胞分化。 结果:大鼠成肌细胞与由胶原蛋白和甲壳素制备的医用可吸收缝合线有很好的薪附，细胞沿缝线呈现串珠样，并可以见到细胞聚集现象。 一3-第一军医大学博士学位抢文24hr后细胞主要为圆球形，随后细胞迁移、伸展、并可以向各个方向伸出突起。体外培养第四天，细胞密集于材料表面，并相互融合，沿材料纵轴排列。并可以见到肌小管形成。与支架材料复合后，细胞增殖迅速，于第4天达到平台期。第6天细胞增殖下降。但是细胞分化呈现逐渐增强趋势。 结论:实验结果提示:借助具有平行结构支架材料体外构建具有良好方向性组织工程化大鼠骨骼肌纤维有一定的可行性。其增殖、分化与骨骼肌再生过程有一定的吻合。 总结:本实验中，作者首先利用离心力与距转轴间距离成正比原理，建立一种简单易行的检测细胞与生物材料间钻附力的方法。并基于不同设计理念，即成肌源性细胞在机械应变下三维培养以及与具有一定方向性支架材料体外培养，探讨体外构建具有良好方向性组织工程化大鼠骨骼肌纤维的可行性。结果显示，上述两种方法均有助于体外形成具有良好方向性的组织工程化大鼠骨骼肌纤维，从而为组织工程化骨骼肌的构建奠定基础。