目的:泛素偶联酶(ubiquitin-conjugating enzyme)UBE2C的主要功能是作为促细胞有丝分裂后期复合物(anaphase promoting complex/cyclosome,APC/C)泛素连接酶(E3)的一种泛素偶联酶,参与细胞周期蛋白和有丝分裂相关因子的泛素化修饰过程,从而发挥其促进细胞有丝分裂进程的作用。UBE2C的过表达能够抑制有丝分裂纺锤体检查点(spindle assembly checkpoint,SAC),使其失去监测功能,引起APC/C的持续活化及CyclinB的泛素化降解,最终导致染色体的错误分离,以及非整倍体细胞的产生。早期研究表明,UBE2C的过表达能够促进肿瘤的增殖和侵袭,并与肿瘤预后密切相关。然而,目前UBE2C在胃癌发生发展中的作用及机制有待于进一步研究。本课题旨在通过检测UBE2C在胃癌组织及血清中的表达情况,分析其与胃癌患者的临床、病理特征以及患者预后的相关性,并探讨其作为胃癌血清分子标志物的可能性;同时,通过体外细胞实验进一步阐明UBE2C在胃癌细胞增殖、凋亡和细胞周期调控中的作用及机制,从而为胃癌的早期诊断治疗及精准治疗提供新的视角和思路。方法:1、收集胃癌组织标本,进行下列检测、分析:(1)Western Blot方法和qRT-PCR法检测30例胃癌标本及癌旁正常粘膜组织中UBE2C蛋白的表达情况。(2)IHC法检测UBE2C蛋白在216例胃癌组织芯片中的表达状况,分析其与年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、Lauren分期、肿瘤病理分级、病理类型、淋巴结转移情况、浆膜浸润和TNM分期,以及与Ki-67和Her-2等标志物之间的关系。(3)Kaplan-Meier法分析UBE2C表达水平与胃癌患者5年生存率之间的关系;多因素COX回归分析预后因素。2、在胃癌细胞系中,进行下列实验:(1)Western Blot方法检测正常胃上皮细胞及胃癌细胞系中UBE2C蛋白的表达情况。(2)选择UBE2C高表达胃癌细胞系,构建并验证UBE2C敲降质粒,与包装质粒共同转染293T细胞后,从培养基上清中收获成熟的慢病毒颗粒;感染胃癌SNU-1细胞24小时后,采用嘌呤霉素筛选稳定沉默UBE2C的SNU1细胞,Western Blot验证敲降效果。(3)细胞功能实验及机制研究,通过WST-1技术分析细胞增殖能力,利用流式细胞仪检测细胞转染后的细胞周期和凋亡水平,检测UBE2C敲降后PARP、p-ERK、p-AKT、p-Wee1、p53及Bcl-2/Bax等相关蛋白表达水平的变化。3、利用血清样本,进行下列检测及分析:(1)ELISA法检测50例胃癌患者、30例慢性胃炎患者及30例正常健康人血清样品中UBE2C蛋白水平,探讨其作为胃癌血清分子标志物的可能性。(2)ELISA法检测胃癌患者手术前后血清中UBE2C蛋白表达水平变化,分析其与胃癌患者临床、病理特征之间的相关性。结果:1、胃癌组织中UBE2C的表达情况:(1)Western Blot和qRT-PCR检测结果显示,UBE2C在胃癌组织中表达水平较高,而在正常胃粘膜组织中无表达或者低表达,二者的差异具有显著性。(2)免疫组化结果显示,UBE2C蛋白主要表达于肿瘤细胞胞质中。胃癌组织中UBE2C蛋白阳性率为67.6%,而相应的癌旁正常黏膜组织中,UBE2C蛋白阳性率为19.4%,二者差异具有显著性;Ki67和Her-2表达水平与UBE2C表达水平存在相关性;UBE2C表达水平与胃癌患者淋巴结转移、浆膜受侵程度以及TNM分期具有统计学差异,而与年龄、性别以及肿瘤分化程度、Lauren分型及肿瘤位置无统计学差异。(3)Kaplan–Meier分析显示UBE2C的高表达与胃癌患者较差的预后具有显著的相关性;多因素COX回归分析显示UBE2C为胃癌的独立预后因素。2、胃癌细胞功能及机制研究:(1)UBE2C在正常胃上皮细胞GES-1中的表达水平明显低于其在胃癌细胞中的水平;在不同胃癌细胞系中,UBE2C表达水平亦有所不同,其中在N87和SNU-1细胞系中表达水平较高。(2)敲降UBE2C能够抑制SNU-1细胞的增殖,两组细胞在各检测时间点均有显著差异;48h后,流式细胞仪检测对照组和敲降组细胞凋亡率显示其从3.02±0.36%上升到18.01±2.15%(P<0.01)。同时,UBE2C敲降后导致SNU1细胞周期阻滞在G2/M期。(3)Western Blot法检测:UBE2C敲降48小时后相关蛋白的表达,发现cleaved-PARP和p-p53表达水平增加;而p-Wee1蛋白表达降低,Bcl-2/Bax比率减低。3、血清中UBE2C蛋白表达情况:(1)在血清中,胃癌患者UBE2C蛋白水平明显高于正常健康人及慢性胃炎患者表达水平,差异具有显著性。(2)胃癌患者血清UBE2C的表达水平与浆膜受侵、Lauren分型及TNM分期具有显著性相关性,而与年龄、性别以及肿瘤大小、分化程度、肿瘤位置无关。手术前后,胃癌患者血清UBE2C蛋白水平无显著性差异。结论:1、UBE2C在胃癌中的表达水平显著高于其在正常胃黏膜组织中的表达水平,与胃癌患者淋巴结转移、浆膜受侵程度以及TNM分期密切相关,可以作为胃癌的一个独立预后因素。2、在胃癌细胞中,敲降UBE2C能够影响细胞周期进程,使胃癌SNU-1细胞阻滞于G2/M期,并促进SNU-1细胞发生凋亡,从而影响其增殖速度;Wee1、p53和Bcl-2通路分别参与了上述由UBE2C介导的生物学调控进程,但其中具体的分子调控机制尚需进一步阐明。上述结果表明,UBE2C可能是胃癌治疗的一个潜在的分子靶点,这为实现胃癌的个体化精准治疗提供了一个新的思路。3、在胃癌患者血清中,UBE2C表达水平较正常人群及慢性胃炎患者显著升高;其高表达是与胃癌发生、发展密切相关的生物学指标。以上结果表明,UBE2C有望成为一种用于胃癌早期筛查及诊断的血清学分子标志物。