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新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的危害最严重的禽类传染病之一,具有高热、呼吸困难、接触性传播、败血经过等特点,给我国及世界养禽业造成了严重的经济损失。目前,免疫接种是预防和控制新城疫的主要途径,但有些时候得不到理想的效果,因此需要探索新的防制策略。本实验室前期通过RNA-Seq技术,筛选出NDV感染机体后与免疫相关的多个差异表达基因,从中挑选出干扰素刺激基因12(1)和12(2)(ISG12(1)/(2))进行抗病毒研究。本论文的主要研究结果如下:(1)NDV感染可诱导ISG12(1)和ISG12(2)表达。在NDV F48E9感染的10日龄SPF鸡胚和4周龄SPF鸡的法氏囊中,利用RT-qPCR对前期转录组数据进行验证,结果表明ISG12(1)/(2)表达显著上调。在不同毒力NDV感染的CEF和DF-1细胞中,也显示ISG12(1)上调,在NDV F48E9感染的DF-1细胞中,ISG12(2)表达也上调。提示ISG12可能在NDV感染中发挥一定的作用。(2)ISG12(1)和ISG12(2)均抑制NDV复制。构建鸡ISG12(1)/(2)的真核表达质粒,转染DF-1细胞后检测过表达ISG12(1)/(2)对NDV复制的影响。结果表明ISG12(1)/(2)过表达均能够显著抑制NDV复制,减少细胞上清中的病毒滴度。将ISG12(1)/(2)的干扰RNA(siRNA)转染DF-1细胞后,ISG12(1)/(2)表达受到抑制,促进了NDV复制。(3)ISG12(1)通过线粒体凋亡通路促进NDV诱导的细胞凋亡从而抑制NDV复制。在DF-1细胞中过表达/敲低ISG12(1),流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示ISG12(1)可促进细胞凋亡。通过激光共聚焦显微镜发现ISG12(1)定位于线粒体,并且ISG12(1)还与促凋亡蛋白Bax共定位且促进Bax由细胞质到线粒体的重新分布。分别通过RT-qPCR以及Western blot检测线粒体凋亡通路相关分子的mRNA及蛋白水平的变化,结果显示过表达ISG12(1)后,促凋亡基因Bax、Bak、Cyt c、caspase3和caspase9显著上调,抑凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl显著下调,干扰ISG12(1)表达后得到相反的结果。这些结果表明ISG12(1)在NDV感染中可以通过线粒体凋亡通路介导细胞凋亡实现对NDV增殖的抑制作用。(4)ISG12(2)通过激活I型干扰素信号通路抵抗NDV感染。首先通过Western blot检测过表达/敲低ISG12(2)后凋亡相关基因的变化,结果显示ISG12(2)对凋亡相关分子影响作用不大,并且通过流式细胞术试验也表明过表达ISG12(2)对细胞凋亡作用不显著,以上结果表明ISG12(2)抑制NDV增殖并非依赖于细胞凋亡途径。过表达ISG12(2)后,利用RT-qPCR方法检测IFNs相关细胞因子变化,发现ISG12(2)过表达可明显促进IFNα和IFNβ的表达,并且促进MDA5、MAVS、IRF7和NF-κB的表达,反之过表达IFNα、IFNβ也可促进ISG12(2)的表达。此外,过表达ISG12(2)的细胞上清可明显抑制猪水泡性口炎病毒(VSV)的增殖,干扰ISG12(2)表达后可得到相反的结果。以上结果表明ISG12(2)可以调节干扰素的产生进而发挥抗NDV作用。通过免疫共沉淀联合质谱分析筛选了14个与ISG12(2)相互作用的宿主蛋白,对这些蛋白进行Go分类和通路分析,它们可能参与生物合成、代谢等生物过程,参与到Toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路等,为深入研究ISG12(2)抗病毒机制奠定基础。综上所述,NDV感染机体后ISG12(1)和ISG12(2)均显著上调,ISG12(1)通过激活线粒体凋亡通路,与促凋亡蛋白Bax共定位诱导细胞凋亡抑制NDV增殖。ISG12(2)则通过促进干扰素的表达来抑制NDV感染。细胞凋亡和天然免疫都是细胞的基本防御机制,ISG12蛋白家族的两个成员分别通过这两种机制抵御病原体的入侵。