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研究背景:儿童急性淋巴细胞白血病是一类严重威胁人类健康的造血干细胞恶性克隆性疾病。急性B淋巴细胞白血病(B-lineage acute lymphoma leukemia,B-ALL)是ALL中最常见的类型,约占儿童ALL的85%～90%。随着诊断水平的不断提高,特别是危险度分层的建立及对化疗方案的不断改进和优化,ALL的缓解率和生存率有了明显提高,但仍有20%左右的患儿出现复发或耐药,导致患儿的预后和生活质量不佳,部分患儿最终死于复发。ALL发病进展机制的复杂性以及对该疾病的生物学特征的有限知识对开发新的治疗方法提出了挑战。研究显示,白血病发生发展、治疗耐药和容易复发的根本原因在于患儿体内存在一群具有自我更新和增殖能力的细胞,即白血病干细胞(Leukemia stem cell,LSCs)。LSCs能自我更新,对凋亡刺激具有耐受性,且高表达MDR1、BCRP1等耐药分子,并能保持肿瘤干细胞特性。LSCs比白血病细胞更能有效抵御化疗药物的杀伤,导致白血病的耐药和复发。因此,只有清除LSCs才有可能根治白血病。因而化疗过程中检测患者体内残留的LSCs对患者的治疗及预后具有极为重要的作用。微小残留病(Minimal residual disease,MRD)是白血病经治疗后体内残留少量白血病细胞的状态,且高表达LSCs,被认为是白血病复发和影响预后的主要原因。早期MRD的检测是评判ALL预后的独立危险因素。选择理想的MRD标志物成为精准检测MRD的前提。由于B细胞发育成熟过程发生在骨髓,所以正常的B祖细胞势必会对判断ALL MRD产生干扰,这是B系急性淋巴细胞白血病MRD判断的难点。同时由于克隆选择及抗原漂移会导致一些白血病在复发时发生免疫表型改变,影响流式细胞术检测MRD的准确性。因此选择稳定表达在MRD上的免疫标志,同时能鉴别是否具有LSCs特性的免疫标志尤为重要。研究显示,CD123(IL-3Rα)为未分化LSCs的特异性标志,在LSCs表面高表达,而在骨髓造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)表面不表达。通过检测CD123水平可以判断白血病增殖情况以及LSCs的数量,通过测定完全缓解患者CD123水平可以预测复发率和生存率。因而检测化疗过程中患儿体内骨髓MRD中CD 123表达水平可以了解患者体内LSCs残留情况,从而准确预测患儿预后。Coustan-Smith等证实,CD123可作为应用于儿童B-ALL的微小残留病(MRD)监测稳定可靠的标志之一,靶向CD123有望成为清除LSCs的有力手段。研究显示,CD58在正常分化B系淋巴细胞中的表达强度随着细胞的成熟度逐渐减低,整体表达呈低水平,而CD58在B-ALL中呈过度表达,表达率在90%以上,明显高于正常儿童骨髓中的B系前体细胞和成熟淋巴细胞,且CD58不受化疗药物影响,表达稳定,B-ALL初治患儿与复发患儿的CD58分子表达强度无显著差别;B-ALL患儿中CD58高表达组的MRD阳性率显著低于CD58低表达组,上述研究为CD58用于B-ALL的MRD检测提供了理论依据。然而因为白血病细胞是病理性细胞,分子表达会出现许多偶然性及不确定性,目前为止,国内外尚无监测MRD的经典组合,这就需要探索多个组合来把握和筛选可能的MRD细胞。本研究采用多参数流式细胞术(Flow cytometry,FCM),应用 CD45/CD19/CD34/CD123/CD58 抗体组合检测 B-ALL患儿诱导化疗第15天、第33天骨髓MRD中稳定表达CD123、CD58的水平,了解患儿体内残留LSCs的情况,并分析两者在儿童B-ALL MRD检测的可行性及与临床特征的相关性。联合检测高表达CD123/CD58的LSCs有望作为MRD监测的新标志,防治白血病的复发。研究目的:本研究通过检测白血病干细胞表面抗原CD 123及B系白血病细胞稳定表达抗原CD58在B-ALL患儿诱导化疗第15天、第33天骨髓MRD中的表达,了解患儿体内MRD中LSCs表达的情况,并分析两者与临床特征的关系。研究方法:1.研究对象:本研究收集山东省立医院自2013年1月至2018年12月收治的B-ALL患儿160例,其中男性患儿91例,女性患儿69例,中位年龄4.7岁(范围1-14岁)。2.实验方法:采用多参数流式细胞术(Flow cytometry,FCM),应用CD45/CD19/CD34/CD123/CD58等抗体组合检测160例B-ALL患儿诱导化疗第15天及第33天的骨髓MRD中CD123、CD58的表达情况,其中154例B-ALL患儿进行了骨髓细胞染色体培养,155例患儿进行白血病相关融合基因检测。同时收集患儿发病初外周血白细胞计数、骨髓幼稚细胞数以及患儿危险度等临床资料,分析诱导缓解后患儿骨髓MRD中CD123、CD58的表达与临床特征的关系。3.统计学方法:本研究应用SPSS17.0和EXCEL统计软件对数据进行分析。计量资料方差不齐用中位数表示,计数资料用卡方检验。当P<0.05时差异具有统计学意义。研究结果:1.CD123在B-ALL诱导化疗第15天、第33天骨髓MRD中的表达及与临床特征的关系在160例B-ALL患儿中,81例诱导化疗第15天骨髓MRD中CD123阳性表达(阳性率50.63%),19例诱导化疗第33天骨髓MRD中CD123阳性表达(阳性率11.86%)。细胞遗传学分析超二倍体组患儿诱导化疗第15天及第33天骨髓MRD中CD123表达阳性率高于非超二倍体(χ2=10.71,P=0.0011;χ2=4.92,P=0.027);患儿诱导化疗第15天及第33天骨髓MRD中CD123表达阳性率在不同危险度之间具有统计学意义(χ2=4.70,P=0.030;χ2=5.24,P=0.022);患儿诱导化疗第 15 天及第33天骨髓MRD中CD123表达阳性率在不同免疫分型、融合基因类型、起病时性别、年龄、白细胞计数、骨髓幼稚细胞数之间都没有统计学意义(P>0.05)。2.CD58在B-ALL诱导化疗第15天、第33天MRD中的表达及与临床特征的关系160例B-ALL患儿中,95例诱导化疗后第15天骨髓MRD中CD58阳性表达(阳性率59.38%),20例诱导化疗后第33天骨髓MRD中CD58阳性表达(阳性率12.50%)。细胞遗传学分析超二倍体组患儿诱导化疗第15天骨髓MRD中CD58表达阳性率高于非超二倍体(χ2=5.46,P=0.019),而第33天两者无统计学意义(χ2=2.51,P=0.11);患儿诱导化疗第15天骨髓MRD中CD58表达阳性率在不同危险度之间无统计学意义(χ2=0.13,P=0.71),而第33天两者具有统计学意义(χ2=5.08,P=0.024);患儿诱导化疗第15天及第33天骨髓MRD中CD58表达阳性率在不同免疫分型、融合基因类型、起病时性别、年龄、白细胞计数、骨髓幼稚细胞数之间都没有统计学意义(P>0.05)。3.CD123CD58在B-ALL诱导化疗第15天、第33天MRD中的双表达及与危险度的关系160例B-ALL患儿中,58例诱导化疗后第15天骨髓MRD中CD123+CD58+表达,阳性率36.25%;9例诱导化疗后第33天骨髓MRD中CD123+CD58+表达,阳性率5.63%。患儿诱导化疗第15天及第33天骨髓MRD中CD123及CD58同时表达阳性率在不同危险度之间具有统计学意义(P=0.012;P=0.015)。研究结论:1.B-ALL患儿诱导化疗第15天及第33天骨髓MRD中CD123阳性表达与患儿危险度、染色体核型存在相关性。与患儿的免疫分型、融合基因类型、发病时的性别、年龄、白细胞计数、骨髓幼稚细胞数均无相关性。2.B-ALL患儿诱导化疗第33天骨髓MRD中CD58阳性表达与患儿危险度存在相关性;第15天骨髓MRD中CD58阳性表达与患儿染色体核型存在相关性。与患儿的免疫分型、融合基因类型、发病时的性别、年龄、白细胞计数、骨髓幼稚细胞数均无相关性。3.B-ALL患儿诱导化疗第33天骨髓CD123+CD58+双阳性表达与患儿危险度呈正相关,阳性率越高,危险度越高。