论文部分内容阅读
菌株SM1127分离自北极王湾地区潮间带的褐藻海带上(坐标:78°55’17.0”N,11°57’0.2”E),经本实验室鉴定为极杆菌属(Polaribacter),因此命名为Polaribacter sp.SM1127。本论文以SM1127为研究对象,对其胞外多糖的发酵条件进行了优化,对胞外多糖进行了分离纯化和结构解析,研究了其胞外多糖的流变学性质,最后探究了 SM1127胞外多糖在生物技术领域的应用潜力。1.北极海洋细菌中胞外多糖产生菌的筛选和鉴定对来源于北极王湾海域的152株细菌经刚果红平板法筛选出8株产胞外多糖较多的菌株,后经液体发酵法筛选出胞外多糖产量最高的菌株SM1127(产糖量为 2.112 ± 0.13 g/L)。对菌株SM1127的16SrRNA基因序列进行测定、分析后,发现其基因序列与菌株 Polaribacter sejongensis KOPRI 21160T(99.13%),Polaribacter butkevichii KMM 3938T(98.67%)和Polaribacter irgensii 23-PT(97.43%)的相似性较高。在系统发育学分析中,菌株SM1127被划分到极杆菌属(Polaribacter),因此将其命名为 Polaribacter sp.SM1127。2.菌株SM1127胞外多糖的发酵条件优化首先通过单因子实验研究了不同碳源、pH、培养温度和时间对胞外多糖产量的影响。研究发现,葡萄糖(30 g/L)作为碳源,pH为8.0,10℃培养5 d时胞外多糖产量较高,达到4.01 ± 0.08 g/L。通过响应面法进一步优化发酵条件。经过PB设计、最陡爬坡实验和CCD设计后,得到最优发酵条件:葡萄糖浓度35 g/L,蛋白胨浓度9.43 g/L,pH 7.5,温度11.25℃,培养时间6d。在此培养条件下,菌株SM1127的胞外多糖产量达到6.12 ± 0.08 g/L,是优化前胞外多糖产量(4.01 ± 0.08 g/L)的1.5倍。这在极杆菌属细菌中是产糖量最高的。以葡萄糖为碳源,在5L发酵罐中对菌株SM1127进行产糖补料发酵后,胞外多糖产量达到17.84 ± 0.22 g/L,是普通摇瓶发酵产量的2.9倍,大大提高了多糖产量。这远高于其它的海洋微生物及现有发酵方法获得的多糖产量。3.菌株SM1127胞外多糖的分离纯化和结构解析菌株SM1127发酵液经过无水乙醇沉淀、酶法除蛋白后得到粗多糖,再经过一次DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和二次Sepharose 4B凝胶层析后得到纯多糖。经过分子筛层析得出胞外多糖的分子量为220 kDa。通过GC/MS得出胞外多糖的糖基组成为:N-乙酰葡萄糖胺(28%)、甘露糖(23.4%)、葡萄糖醛酸(21.4%)、半乳糖(17.4%)、海藻糖(7.4%)、葡萄糖(1.6%)、鼠李糖(0.8%)。胞外多糖的糖苷键连接方式主要包括:4-连接的葡萄糖醛酸残基(13.2%)、2-连接的半乳糖残基(13.0%)、末端半乳糖残基(11.5%)和4-连接的葡萄糖残基(10.2%)等,连接方式呈现多样化。这是对极杆菌属细菌胞外多糖的糖苷键连接方式的首次研究。4.菌株SM1127胞外多糖的流变学性质研究随着胞外多糖溶液浓度的升高,其粘度逐渐增大,且二者不呈线性关系,表现为非牛顿流体特性。随着作用于胞外多糖剪切力的剪切速率增大,多糖溶液粘度逐渐减小,表现为假塑性流体特性。当将恒定的剪切力作用于多糖溶液时,其粘度逐渐下降,静止后又恢复,表现为正触变性。另外,胞外多糖具有良好的温度稳定性(10℃～80℃)、pH稳定性(5～12)和盐稳定性(NaCl和CaC12浓度为1%～10%),在石油开采等工业领域具有良好的应用潜力。5.菌株SM1127胞外多糖的应用潜力研究KM小鼠的急性经口毒性实验表明多糖的半数致死量(LD50)大于5000 mg/kg,属无毒级别。日本白色大耳兔的皮肤刺激性实验表明多糖的急性皮肤刺激指数(PⅡ)和连续皮肤刺激性指数(CⅡ)皆为0,无刺激性。在相对湿度为43%和81%的条件下,多糖的吸湿率分别为10.0± 0.5%和22.1±0.6%;在干硅胶环境中放置72 h后,多糖的保湿率为75.79± 2.5%,表明多糖具有良好的吸湿性和保湿性。这是对北极微生物胞外多糖具有吸湿、保湿性的首次研究,且其保湿性优于已报道的其他多糖。胞外多糖在浓度为10.0 mg/mL的条件下,对有机自由基1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-·)的清除率分别达到55.40 ±3%、52.1 ±2.1%和28.2 ±3%,具有良好的抗氧化性。这是对北极细菌胞外多糖具有抗氧化性的首次研究。另外,人真皮成纤维细胞(HDF)在含有不同浓度胞外多糖的细胞培养液中4℃培养20 h后,随着胞外多糖浓度的升高,细胞活性逐渐升高,即胞外多糖能维持细胞的活性。这说明胞外多糖对HDF有低温保护作用,可作为低温保护的有效成分添加入皮肤防冻乳(霜)中,这是多糖对人皮肤细胞具有低温保护作用的首次研究。以上说明胞外多糖在医药、化妆品等领域具有良好的应用潜力。