第一部分胃肠外科手术后腹腔引流液的分析检测目的：探讨胃肠外科患者手术后腹腔引流液中炎症因子成分的浓度变化规律方法：利用外科手术术后腹腔内常规留置腹腔引流管的治疗特点,不额外增加创伤的收集手术后患者的腹腔引流液。取患者在手术刚开始时,取患者刚开腹时的腹腔内腹水；并收取患者在手术后1-7天的,每日清晨时分时间点,患者腹部的腹腔引流管引流出的新鲜的腹腔引流液。在4℃10000 rpm、min离心处理后,收取上清液并存在-80℃冰箱。在完成足够例数的引流液收集后,使用ELISA法检测患者腹腔引流液中炎症因子IFN-γ、IL一17以及TGF-β的浓度改变情况。给每例患者均绘制手术后腹腔内IFN-γ、IL—17以及TGF-β的浓度变化曲线图。使用方差分析的统计学分析方法比较不同时间点上述检测指标变化的差异性。结果：从2012年10月至2014年4月,共收集了武汉协和医院胃肠外科接受了开腹手术的结肠癌根治术患者60例(已排除所有在术后出现了肠漏／疑似感染等特殊情况的患者)。可见在手术前,患者的腹腔液体中,IL-17与IFN-γ均处于极低水平。临床手术后患者的腹腔引流液中IL-17含量在手术后12h即已经开始上升,术后24h即达到峰值(68.18±12.36 pg/ml).随后迅速下降,在手术后第二天,IL-17已经下降到峰值的一半以下(33.16±7.24 pg/ml)；手术后第4d,IL-17已经基本降低到基线水平。与IL-17变化趋势类似,临床手术患者的腹腔引流液中,IFN-γ含量在手术后12h也开始迅速上升,术后第2d达到峰值(75.77±11.21pg/ml);IFN-γ维持在较高浓度到第4d开始下降,术后第六天达到基线水平。与此不同的是,患者TGF-β在手术后12h即达到峰值82.42±10.12 pg/ml。随后其浓度逐渐下降到第3d的37.50±7.22pg/m1.从第4天开始到患者拔出引流管的第7天,腹腔TGF-β浓度再次开始上升,其中第6d再次达到第二个峰值(95.12±16.19pg,/m1)结论：(1)腹部手术后,患者腹腔引流液中,炎症因子IL-17和IFN-γ含量在手术后1-2d迅速升高并达到峰值,随后其浓度迅速下降(在没有术后并发感染的前提下),在手术后5-7d,重新回归到类似于术前的基线水平。(2)腹部手术后,患者腹腔引流液中,纤维化相关因子TGF-β在手术后呈现两个峰值。第一个峰值出现在手术后12-24h,随后TGF-β浓度会下降,但随后会在第4d左右再次上升,在术后6-7d重新达到新的峰值。第-2部分小鼠腹腔粘连模型的构建与评估目的：探讨如何在实验动物模型中稳定模拟外科手术术后腹腔粘连形成的过程方法：参考目前已有的文献报道,采用开腹手术的方式构建小鼠腹腔粘连模型。具体执行过程为：使用灭菌的3%水合氯醛,按照小鼠体重给药,给药剂量为8κl/g：给药方式采取腹腔注射。腹腔注射后大约5分钟左右,小鼠即进入麻醉状态。以小鼠四肢无主动运动,止血钳试探性夹脚无反应为麻醉满意指标,即可开始实验。为确保小鼠手术创伤类同,取腹部正中线切口2cm,依次切开皮肤,腹肌进入腹腔。使用无菌纱布缠绕止血钳并使用生理盐水打湿。采取以下不同策略模拟手术创伤：A：腹壁摩擦20次B：盲肠及其上下段每隔2cm一处一个点共5个点,每个点摩擦20次C：A+BD：A+B但摩擦次数均减半A,B,C,D四组老鼠每组10只。完成手术后第7天,处死小鼠并打开小鼠腹腔,观察粘连形成情况,粘连形成评估采取以下评分体系进行：0：无粘连1：1处轻微的易剥离粘连2：>1处轻微的易剥离粘连3：存在1处较重的不易分离的粘连4：存在>1处的较重的不易分离的粘连5：存在多处较重的不易分离的粘连且粘连中有血管组织形成分别评估A,B,C,D四组手术方法下,四组老鼠的粘连形成情况及死亡率情况,选取死亡率偏低而粘连形成比率最高的一组最为腹腔粘连模型构建组。结果：手术后7d处死小鼠后进行腹腔粘连评分及死亡率比较,结果如下：A组：粘连得分1.8±0.3死亡率0%B组：粘连得分4.0±0.2死亡率20%C组：粘连得分4.3±0.5死亡率20%D组：粘连得分4.2±0.4死亡率0%结论：单独摩擦损伤腹膜并不能有效的诱导腹腔粘连形成,过度的摩擦肠壁将会导致肠道穿孔进而致使小鼠死亡。只有同时摩擦腹壁及肠道,并控制摩擦次数,才能在保证低死亡率的背景下有效的控制小鼠腹腔粘连的稳定及成型。因此应该选择盲肠及其上下段每隔2cm一处一个点共5个点,每个点摩擦10次+腹壁摩擦10次的方法进行小鼠腹腔粘连模型的造模。第三部分 小鼠腹腔粘连模型中IL-17,IFN-γ及TGF-β的表达规律及来源分析目的：研究在腹腔粘连模型下,小鼠腹部炎症因子IL-17及IFN-γ在术后不同时间点的变化规律,并分析这些炎症因子的来源及效果。同时评估纤维化形成相关关键因子TGF-β在腹腔中的浓度变化趋势规律。方法：选取手术前,标准手术后2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h,分别处死小鼠,腹腔注射无菌PBS2ml,腹腔轻柔按摩5min后,回抽腹腔灌洗液,并予以离心,洗涤,分离,细胞计数观察炎症细胞的浸润程度变化(细胞计数)、再给予染色CD4、IL-17 and IFN-γ,使用FACS(流式细胞术)检测并评估各型细胞的数量变化反复重复实验后,进行数据统计并得出变化趋势图。同时,对每一步离心后的上清液,快速存储于-80℃冰箱,待各个时间点各种样本收齐后,使用ELISA法,测定腹腔灌洗液中上述因子的浓度改变情况。结果：小鼠手术前基线状态下,腹腔内IL-17,IFN-γ含量接近于0(基线水平)。在手术后4h,小鼠的腹腔内IL-17即迅速升高到峰值(123.56±19.28 pg/ml,随后开始缓慢下降,在手术后第48h下降到46.72±7.17pg/ml,之后逐渐回归基线水平。小鼠术后12h,IFN-γ上升到峰值70.95±19.29pg/mI随后迅速下降到72h即处于基线水平。小鼠腹腔TGF-β在手术后4h即达到第一个峰值66.79±10.18pg/ml.随后逐渐下降到时候24h达到低值19.18±5.28 pg/ml。随后浓度会再次上升到时候第72h再次达到高峰103.25±20.14pg/ml.在术后炎症反应的峰值4-12h,小鼠腹腔中分泌IFN-γ的细胞主要为Thl细胞,分泌IL-17的细胞为γδT,Thl7细胞。结论：与临床标本数据十分类似,在小鼠腹腔粘连的模型中,也存在在术后早期的IL-17,IFN-γ急性峰值。同时也可观察到时候1-7d的时间内,存在TGF-β的双峰现象。而在小鼠模型中的手术后急性炎症期,γ8T, Th1细胞急性分泌IL-17和IFN-γ,构成了术后早期炎症反应的峰值。第四部分小鼠腹腔粘连模型的干预及疗效分析目的：探讨抗炎治疗及抗纤维化治疗的治疗时间点及疗效评估。方法：依据第三部分中测定的小鼠腹腔炎症因子及TGF-P变化规律特点采取不同干预治疗对策如下：(1)抗炎治疗评估：分别使用不同浓度梯度的anti-IL-17; anti-IFN-y;在手术后0-2天,每天注射一次(d0,dl,d2),观察治疗效果。再使用浓度梯度实验中的最佳梯度浓度,分别选取术后1-3天(d1,d2,d3),术后4-6天(d4,d5,d6)两组不同时间点,分别每天注射一次,观察抗粘连起效的最佳时间点。(2)抗纤维化评估：参照抗炎治疗策略,使用anti-TGF-β;观察手术后使用不同浓度梯度及时间梯度下,anti-TGF-β对于防治腹腔粘连的效应评价。结果：100μg的抗体用量为炎症因子IL-17, IFN-y阻断的最佳剂量。早期阻断IL-17(术后d0-d2)的抗粘连效果显著高于晚期阻断(术后d4-d6)(1.7±0.6 vs 4.14±0.9,p=0.001)。与此类似早期阻断IFN-γ(术后d0-d2)的抗粘连效果显著高于晚期阻断(术后d4-d6)(1.5+0.4 vs 4.0±0.8,p=0.001)。但是对于TGF-β,晚期阻断(术后d4-d6)的抗粘连效果显著高于早期阻断(术后d1-d3)(4.2±0.8 vs 1.3±0.6,p=0.003)结论：早期的抗炎症处理和晚期的抗TGF-β处理可预防术后粘连的形成。与此相反,晚期的抗炎处理和早期的抗TGF-β处理对于腹腔粘连的形成没有影响。第五部分炎症因子与纤维化因子相互间影响机制分析目的：探讨早期炎症反应对于后期纤维化环境平衡的影响及其作用机制。方法：处死小鼠后,腹腔注射2m1胰酶-EDTA消化液；37℃下摇床轻度摇15min。吸出消化液并加10%FBS的DMEM培养基中和。离心后收集并于6孔板中培养。原代培养的腹膜间皮细胞培养时间约为1周左右,在培养的第二周开始进行传代培养。对传代培养后指数生长期的活性良好的间皮细胞进行实验。模拟第三、四部分获得的腹腔粘连炎症及纤维化环境,采取IL-17/IFN-y刺激24h+TGF-β刺激24h的治疗策略,在完成共计48h的刺激策略后,收齐培养细胞的上清液测定其中t-PA/PAI-1浓度；并使用WB测定细胞中TGF-β的信号通路激活情况。评价上述炎症因子对于间皮细胞的纤维化相关信号通路,如Smad2/3, Smad7的差别影响。同时,收取第四部分中,接受不同抗体处理组小鼠的粘连组织,匀浆处理后收集其中mRNA.测定其中与Thl,Th17,yδT相关的趋化因子如SDF-1, CCL-20/22/27, KC, MIP-1/2等的表达水平改变情况。结果：在细胞培养上清液检测方面：PBS对照组中上清液中t-PA含量为101.32±15.12ng/ml;PAI含量为42.85±10.13ng/ml. IL-17预刺激组上清液中t-PA含量为51.12±6.02ng/ml;PAI含量为82.45±11.33ng/ml.IFN-y刺激组上清液中t-PA含量为91.12±11.32ng/ml;PAI含量为82.45±11.33ng/ml. IL-17+IFN-y刺激组上清液中t-PA含量为31.12±802ng/ml;PAI含量为162.45±25.93ng/ml.其中IL-17+IFN-y刺激处理后再使用TGF-β进行刺激,间皮细胞分泌的t-AP显著减少,PAI-1显著增加。在刺激后的细胞mRNA检测方面：PBS对照组中间皮细胞t-PA/PAI-1 mRNA表达为1.0(作为对照组标准化).IL-17预刺激组中间皮细胞t-PA mRNA表达为0.42±0.13；PAI 2.46±0.78. IFN-y刺激组间皮细胞t-PA mRNA表达为1.02±0.43；PAI 0.99±0.18.IL-17+IFN-y刺激组间皮细胞t-PA mRNA表达为0.22±0.10；PAI 6.484±2.08.其中IL-17+IFN-y刺激处理后再使用TGF-β进行刺激,间皮细胞表达的t-AP显著减少,PAI-1显著增加。WB检测也提示：与直接TGF-β刺激处理相比,IL-17+IFN-y提前预刺激处理下的间皮细胞具有更强的Smad 2/3激活比例。对手术后形成的粘连组织进行qPCR检测炎症趋化因子的mRNA结果为：CCL-22及KC表达显著提高,其他趋化因子表达差异不明显。结论：IL-17+IFN-y刺激下的间皮细胞,对TGF-β的反应性更强。其下游信号通路Smad2/3激活也更强。与此对应的,其上清液中,促纤维化因子PAI-1的含量也越高。手术后,腹膜间皮组织中,炎症趋化因子表达显著提高,间皮细胞趋化炎症因子的能力也在术后显著增强,其中SDF-1, CCL-22是手术前后显著增加的趋化因子。