论文部分内容阅读
第一部分NGF在Matrigel内对血管生成的影响及可能机制目的：探讨NGF在Matrigel内促血管生成的作用及可能机制。方法：10-12周龄健康雄性SD大鼠24只，体重250±20克，随机分为四组：IgG组、NGF组、anti-NGF组、TAE226组，14天后取材，分别进行组织学评分，采用免疫组织化学方法检测Matrigel内的CD31和α-SMA蛋白的表达，Western blot检测P-FAK蛋白含量的变化。结果：1．NGF组中可见新生血管，分布于Matrigel的周围，IgG组可见有中等量的细胞浸润，散见有血管形成，anti-NGF组和TAE226组散在有细胞浸润在胶中。组织学评分NGF组分别为IgG组的2倍，anti-NGF组和TAE226组的3倍左右。2．CD31在IgG组Matrigel中有中等量阳性细胞表达，NGF组有大量阳性表达，并见树枝样分布，anti-NGF组和TAE226组Matrigel中少见阳性细胞表达。α-SMA阳性表达产物在NDF组最多，其次为IgG组，anti-NGF组最少，anti-NGF组与TAE226组比较无明显差异（P＞0.05），IgG组α-SMA阳性细胞的表达较anti-NGF组和TAE226组稍多。3．NGF组的P-FAK蛋白含量明显高于IgG组和anti-NGF组，anti-NGF组P-FAK蛋白含量较IgG组减少，由于FAK蛋白的磷酸化作用受阻，TAE226组其P-FAK蛋白含量明显降低。结论：NGF在Matrigel内具有促血管生成作用，其机制可能与P-FAK依赖的整合素—FAK信号通路作用有关。第二部分NGF对脑缺血后血管再生的影响及与整合素—FAK信号通路的关系目的：观察NGF和整合素—FAK信号通路对脑血管再生的作用，分析NGF对此通路的影响，探讨NGF对脑血管生成的影响及可能机制。方法：10-12周龄健康雄性SD大鼠282只，体重250±20克，随机分为六组：正常对照组、假手术组、脑缺血组、TAE226干预组、NGF治疗组和NGF＋TAE226干预组，分别在不同时间点取材，ELISA观察侧脑室注射NGF后缺血周围区其含量变化，免疫组化检测CD31和α-SMA的表达，观察缺血周围区新生血管数目，RT-PCR检测integrinαvβ3和TrkA mRNA在顶叶大脑皮质缺血周围区的表达变化，western blot检测P-FAK蛋白的表达变化。结果1．脑缺血后3h即发现内源性NGF的含量升高，在1d后含量达8～9 ng／g左右，NGF组脑缺血周围区NGF含量从3h开始明显升高，第1d最高，第3d有明显的下降，与脑缺血组比较，差异显著，有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。2．NGF组较缺血组新生血管数量有明显的增多（P＜0.01），TAE226组和NGF＋TAE226组新生血管数目少于脑缺血组（P＜0.05），NGF＋TAE226组新生血管数目多于TAE226组，少于脑缺血组。3．正常及假手术组有少量CD31蛋白表达，脑缺血组CD31蛋白缺血后第1天即有表达，第7天达高峰，TAE226组CD31蛋白的表达水平在7天和14天与脑缺血组有显著性差异（P＜0.01），NGF组CD31蛋白从第1天开始有明显表达，第7天达到高峰，28天仍有较高水平的表达，在7天、14天和28天与脑缺血组有较明显差异（P＜0.05），NGF＋TAE226组CD31蛋白的表达强于TAE226组，弱于脑缺血组。正常及假手术组有少量α-SMA蛋白表达，脑缺血组α-SMA蛋白在缺血后第1天有少量表达，第14天达到高峰，在28天开始下降，TAE226组α-SMA蛋白的表达在7天、14天和28天与脑缺血组有显著性下降（P＜0.01或P＜0.05），NGF组α-SMA蛋白的表达从第1天开始即强于脑缺血组，14天和28天有高水平α-SMA蛋白的表达，与脑缺血组有较明显差异（P＜0.01），NGF＋TAE226组α-SMA蛋白的表达与CD31蛋白的表达相似强于TAE226组，弱于脑缺血组。4．脑缺血组顶叶缺血周围区皮质中的TrkA mRNA表达从3天开始明显升高，7～14天维持在较高水平的表达，NGF组的TrkA mRNA表达较缺血组有明显的增高，从3天起两组间比较具有明显的差异（P＜0.01）。5．脑缺血组整合素αvβ3 mRNA从1天开始表达，第7天表达明显增高，14天达到高峰，NGF组整合素αvβ3 mRNA的表达有明显增多，在3天之后的时间点表达较脑缺血组有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），TAE226组和NGF＋TAE226组结果分别与脑缺血组和NGF组相似。6．脑缺血组P-FAK蛋白的表达14天前呈逐渐升高的趋势，第14天后急剧下降，NGF组在3天、7天、14天和28天P-FAK蛋白的表达水平均脑较缺血有较明显的升高（P＜0.05或P＜0.01），在TAE226组和NGF＋TAE226组P-FAK蛋白的表达水平较低，在第7天和14天与脑缺血组有明显的差异（P＜0.05或P＜0.01）。结论NGF促脑血管生成的作用可能与整合素—FAK信号通路密切相关，而NGF激活整合素—FAK信号通路与TrkA的表达有关。第三部分抑制NGF的促血管生成作用对神经再生的影响目的：通过阻断FAK的磷酸化过程来抑制NGF的促血管生成作用，在脑缺血后14天观察SVZ和SGZ区神经再生的情况，探讨NGF促血管再生和神经再生二者的联系，以期为治疗缺血性脑血管病提供新思路和新手段。方法：10-12周龄健康雄性SD大鼠24只，体重250±20克，随机分为四组：假手术组、脑缺血组、NGF治疗组、NGF治疗＋TAE226干预组，术后第14天取材，取材前连续三天腹腔注射Brdu，取室管膜下区和海马齿状回区脑组织做组织切片，行免疫组织化学染色和荧光标记，观察神经元、神经胶质细胞在室管膜下区和海马齿状回区的表达变化。结果1．假手术组和脑缺血组少见Brdu的标记阳性细胞，NGF组可见较多Brdu标记的阳性细胞（与缺血组比较，P＜0.01），NGF＋TAE226组Brdu标记的阳性细胞数量少于NGF组（P＜0.05），多于脑缺血组（P＜0.05）。2．NGF组SVZ和SGZ区可见DCX蛋白的表达增加，以SVZ区更为明显，NGF＋TAE226组发现DCX蛋白的表达较NGF组有下降趋势，在脑缺血组少有DCX蛋白的表达，分析NGF组和NGF＋TAE226组Brdu标记的阳性细胞与DCX蛋白共同标记的阳性细胞数目，发现NGF＋TAE226组较NGF组双标的阳性神经元数目有较明显下降（P＜0.05）。3．脑缺血组和假手术组未见有明显的NG2蛋白的表达，NGF组和NGF＋TAE226组NG2蛋白的表达呈中等程度的增加，NGF组多于NGF＋TAE226组，比较无明显统计学意义（P＞0.05），比较NGF组和NGF＋TAE226组Brdu标记的阳性细胞与NG2蛋白双标的阳性细胞数目，差异无统计学意义（P＞0.05）。NGF组GFAP的表达较NGF＋TAE226组有明显的增多（P＜0.05），分析NGF组和NGF＋TAE226组Brdu标记的阳性细胞与GFAP蛋白共同标记的阳性细胞数目，NGF＋TAE226组双标的阳性细胞数量少于NGF组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：NGF的促血管生成作用有利于缺血后神经再生。