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第一部分冷诱导RNA结合蛋白是减轻体外循环血脑屏障损伤的新靶点
研究目的
低温可保护神经系统，并减轻体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)后的脑损伤。低温可促进冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)的表达，并作为一种关键调节蛋白在脑组织中发挥作用。然而CIRP在CPB的机制尚不清楚，因此，本研究基于大鼠低温CPB心脏停跳模型，应用CIRP敲除大鼠，探索CIRP在低温CPB所致脑损伤中的作用。
研究方法
通过转录激活物样效应核酸酶基因编辑技术获取CIRP敲除大鼠。大鼠随机分为三组(n=5):假手术组、CPB组和CPB+CIRP-/-组(CIRP-/-组)。大鼠尾动脉及右颈静脉右心房插管建立CPB模型，将作为阻断钳的球囊导管，经右颈总动脉逆行插入升主动脉。直肠温降至32℃后，阻断升主动脉并灌注托马斯心脏停搏液。30分钟后开放升主动脉，复温至直肠温34.5℃且血流动力学稳定后停机，机械通气辅助1小时后断颅取脑组织标本。术中监测血流动力学参数、动脉血气值和直肠温度。在CPB开始前、升主动脉阻断前、开放升主动脉前和CPB结束后4个时间点，取动脉血进行血气分析。在CPB组和CIRP-/-组中各随机选取三个样本进行转录组学测序。检测海马匀浆中CIRP、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1、基质金属蛋白酶(matrix metallopeptidase，MMP)-9、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白介素(interleukin,IL)-4、IL-5、IL-10、IL-13、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和紧密连接蛋白指标闭合蛋白(occluding，0cc)、致密闭锁带(zona occludens， ZO)-1的表达。透射电镜和免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)免疫组化染色评价血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的完整性。检测血清脑损伤标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)含量。苏木精伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色、尼氏染色和TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2-deoxyuridine，5-triphosphate nick-end labeling staining)评估脑组织病理损伤。
研究结果
低温CPB后海马CIRP表达显著增加(0.00±0.00vs0.51±0.04;P＜0.0001)。基因本体论(gene ontology，GO)与京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析表明，多数差异基因(P＜0.05)功能聚集于BBB渗漏。CIRP-/-组海马TGF-β1(273±81vs169±65;P=0.018)、MMP-9(0.62±0.12vs0.33±0.06;P＜0.001)、TNF-α(3.61±0.96vs2.12±0.35;P=0.003)和MDA(223±43vs101±30;P=0.0001)含量显著高于CPB组。而IL-4表达量在CIRP-/-组显著低于CPB组(2.49±0.43vs3.69±0.73;P=0.002)。透射电镜观察和免疫组化IgG外渗的半定量分析(6.36±0.68vs1.92±0.54;P＜0.0001)显示，CIRP-/-组存在更严重的BBB破坏。CIRP-/-组的紧密连接蛋白表达明显低于CPB组(0.03±0.01vs0.08±0.040cc，和0.04±0.01vs0.09±0.03ZO-1;P=0.007，0.0058分别)。此外，CIRP-/-组血清GFAP水平显著高于CPB组(49±12vs24±7;P=0.0011)，且海马病理损伤{病理评分(3.0，[2.0-3.0]vs1.0[0.5-1.0]，P＜0.0001)、存活海马神经元(802±216vs3369±564;P＜0.0001)和TUNEL标记阳性神经元(15.98±3.05vs0.70±0.14;P=0.0012)}在CIRP-/-组比CPB组更加严重。因此CIRP可明显减轻神经损伤。
研究结论
CIRP在低温CPB中通过减轻BBB破坏而发挥重要的神经保护作用，这可能与TGF-β1-MMP-9信号通路有关。
第二部分冷诱导RNA结合蛋白在深低温停循环通过Brd2/NF-κB通路介导小胶质细胞炎症
研究目的
神经炎症是深低温停循环(deep hypothermic circulatory arrest，DHCA)后神经系统损伤的原因之一。DHCA引起的小胶质细胞活化可启动炎性应答，加重神经元损伤。但DHCA期间小胶质细胞激活的具体分子机制仍不清楚。本研究基于大鼠DHCA模型和细胞氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，应用CIRP敲除大鼠和Cirp小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)腺病毒载体，假设冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)可促进DHCA诱导的神经炎症。
研究方法
将大鼠随机分为三组(n=5):假手术组、DHCA组和DHCA+CIRP-/-组(CIRP-组)。大鼠尾动脉灌注，静脉引流经右颈静脉插管至右心房，建立体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)30分钟内将肛温降至18℃后停循环30分钟，复温60分钟至34℃以上停机，呼吸机辅助支持60分钟后断颅取脑组织标本。各组均在CPB开始前、停循环前和CPB结束后3个时间点，取动脉血进行血气分析。含CIRP-siRNA或阴性对照siRNA的腺病毒载体，预处理小鼠小胶质BV2细胞后，48小时后在18℃进行OGD4小时，收集各组BV2细胞和上清培养液。并将上清培养液加入视黄酸诱导分化的SHSY5Y细胞，在18℃OGD4小时后收集各组细胞。苏木精伊红(hematoxyl in and eosin， HE)染色、尼氏染色和TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2-deoxyuridine, 5-triphosphate nick-end labeling staining)评估神经元病理损伤。离子钙结合接头分子(ionizing calcium-binding adaptor molecule，Iba)-1免疫荧光染色评价小胶质细胞活化程度。多因子检测海马匀浆肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白介素(interleukin，IL)-5、IL-10和IL-13含量。在DHCA组和CIRP-/-组中各随机选取三个样本进行转录组学测序。qPCR检测海马组织Brd2mRNA表达量。WesternBlot检测各组海马匀浆和BV2细胞裂解中CIRP、Brd2、NF-κB-p65、IκBα的蛋白含量。免疫荧光观察各组海马区和BV2细胞CIRP与Brd2的表达与分布。Elisa法检测BV2细胞裂解液和上清培养液TNF-α含量。MTT检测各组BV2细胞毒性。流式细胞检测膜联蛋白V-FITC/PI标记的凋亡SHSY5Y细胞。
研究结果
野生型大鼠DHCA后CIRP表达显著增加(0.42±0.04vs0.74±0.06，P＜0.01)，伴有明显的神经炎症和神经元损伤。CIRP-/-大鼠经历DHCA后，组织损伤{病理评分(3.0，[2.0-3.0]vs1.0[1.0-1.5]，P＜0.001)、存活海马神经元(260±53vs581±51;P=0.001)和TUNEL标记阳性神经元(21±12vs4±2;P=0.007)}和小胶质细胞活化(40±4vs.13±7CA1区，P＜0.001)减轻。通过对RNA测序结果的验证，可能与抑制Brd2/NF-κB炎性通路(0.07±0.01vs0.03±0.01Brd2,0.61±0.11vs0.43±0.08NF-κB-p65和0.05±0.04vs0.21±0.09IκBα;P＜0.001，=0.014和0.003分另)，造成主要的炎性细胞因子释放减少(5.71±3.66vs1.56±0.82TNF-α，19.00±1.47vs13.71±2.05IL-5，和1.07±0.12vs0.71±0.15IL-13;P=0.031，0.001和0.002分别)有关。经历18℃OGD后BV2细胞CIRP表达明显增多(0.018±0.006vs0.036±0.003;P＜0.001)。在siRNA-CIRP处理的BV2细胞中，观察到类似的保护作用，包括减少的炎性细胞因子(73±11vs51±8细胞内TNF-α，和153±25vs67±13细胞外TNF-α;P=0.002和＜0.001分别)和降低的细胞毒性(1.58±0.15vs2.28±0.19;P＜0.001)。通过加入Brd2的抑制剂JQ1，在细胞水平进一步证实了下游的Brd2/NF-κB信号通路(0.20±0.05vs0.33±0.04Brd2,0.53±0.16vs0.56±0.14NF-κB-p65和0.85±0.26vs0.82±0.27IκBα;P=0.213，0.827和0.749分别)。此外，siRNA-CIRP转染的BV2细胞的条件培养基，能显著降低OGD后类神经元SH-SY5Y细胞的凋亡(40±8vs20±2;P＜0.001)，且加入JQ1有相似的作用(40±8vs21±1;P＜0.001)。
研究结论
DHCA期间小胶质细胞内表达增加的CIRP，可能通过Brd2/NF-κB信号通路，促进炎性细胞因子的释放而加重神经元损伤。
研究目的
低温可保护神经系统，并减轻体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)后的脑损伤。低温可促进冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)的表达，并作为一种关键调节蛋白在脑组织中发挥作用。然而CIRP在CPB的机制尚不清楚，因此，本研究基于大鼠低温CPB心脏停跳模型，应用CIRP敲除大鼠，探索CIRP在低温CPB所致脑损伤中的作用。
研究方法
通过转录激活物样效应核酸酶基因编辑技术获取CIRP敲除大鼠。大鼠随机分为三组(n=5):假手术组、CPB组和CPB+CIRP-/-组(CIRP-/-组)。大鼠尾动脉及右颈静脉右心房插管建立CPB模型，将作为阻断钳的球囊导管，经右颈总动脉逆行插入升主动脉。直肠温降至32℃后，阻断升主动脉并灌注托马斯心脏停搏液。30分钟后开放升主动脉，复温至直肠温34.5℃且血流动力学稳定后停机，机械通气辅助1小时后断颅取脑组织标本。术中监测血流动力学参数、动脉血气值和直肠温度。在CPB开始前、升主动脉阻断前、开放升主动脉前和CPB结束后4个时间点，取动脉血进行血气分析。在CPB组和CIRP-/-组中各随机选取三个样本进行转录组学测序。检测海马匀浆中CIRP、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1、基质金属蛋白酶(matrix metallopeptidase，MMP)-9、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白介素(interleukin,IL)-4、IL-5、IL-10、IL-13、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和紧密连接蛋白指标闭合蛋白(occluding，0cc)、致密闭锁带(zona occludens， ZO)-1的表达。透射电镜和免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)免疫组化染色评价血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的完整性。检测血清脑损伤标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)含量。苏木精伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色、尼氏染色和TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2-deoxyuridine，5-triphosphate nick-end labeling staining)评估脑组织病理损伤。
研究结果
低温CPB后海马CIRP表达显著增加(0.00±0.00vs0.51±0.04;P＜0.0001)。基因本体论(gene ontology，GO)与京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析表明，多数差异基因(P＜0.05)功能聚集于BBB渗漏。CIRP-/-组海马TGF-β1(273±81vs169±65;P=0.018)、MMP-9(0.62±0.12vs0.33±0.06;P＜0.001)、TNF-α(3.61±0.96vs2.12±0.35;P=0.003)和MDA(223±43vs101±30;P=0.0001)含量显著高于CPB组。而IL-4表达量在CIRP-/-组显著低于CPB组(2.49±0.43vs3.69±0.73;P=0.002)。透射电镜观察和免疫组化IgG外渗的半定量分析(6.36±0.68vs1.92±0.54;P＜0.0001)显示，CIRP-/-组存在更严重的BBB破坏。CIRP-/-组的紧密连接蛋白表达明显低于CPB组(0.03±0.01vs0.08±0.040cc，和0.04±0.01vs0.09±0.03ZO-1;P=0.007，0.0058分别)。此外，CIRP-/-组血清GFAP水平显著高于CPB组(49±12vs24±7;P=0.0011)，且海马病理损伤{病理评分(3.0，[2.0-3.0]vs1.0[0.5-1.0]，P＜0.0001)、存活海马神经元(802±216vs3369±564;P＜0.0001)和TUNEL标记阳性神经元(15.98±3.05vs0.70±0.14;P=0.0012)}在CIRP-/-组比CPB组更加严重。因此CIRP可明显减轻神经损伤。
研究结论
CIRP在低温CPB中通过减轻BBB破坏而发挥重要的神经保护作用，这可能与TGF-β1-MMP-9信号通路有关。
第二部分冷诱导RNA结合蛋白在深低温停循环通过Brd2/NF-κB通路介导小胶质细胞炎症
研究目的
神经炎症是深低温停循环(deep hypothermic circulatory arrest，DHCA)后神经系统损伤的原因之一。DHCA引起的小胶质细胞活化可启动炎性应答，加重神经元损伤。但DHCA期间小胶质细胞激活的具体分子机制仍不清楚。本研究基于大鼠DHCA模型和细胞氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，应用CIRP敲除大鼠和Cirp小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)腺病毒载体，假设冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)可促进DHCA诱导的神经炎症。
研究方法
将大鼠随机分为三组(n=5):假手术组、DHCA组和DHCA+CIRP-/-组(CIRP-组)。大鼠尾动脉灌注，静脉引流经右颈静脉插管至右心房，建立体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)30分钟内将肛温降至18℃后停循环30分钟，复温60分钟至34℃以上停机，呼吸机辅助支持60分钟后断颅取脑组织标本。各组均在CPB开始前、停循环前和CPB结束后3个时间点，取动脉血进行血气分析。含CIRP-siRNA或阴性对照siRNA的腺病毒载体，预处理小鼠小胶质BV2细胞后，48小时后在18℃进行OGD4小时，收集各组BV2细胞和上清培养液。并将上清培养液加入视黄酸诱导分化的SHSY5Y细胞，在18℃OGD4小时后收集各组细胞。苏木精伊红(hematoxyl in and eosin， HE)染色、尼氏染色和TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2-deoxyuridine, 5-triphosphate nick-end labeling staining)评估神经元病理损伤。离子钙结合接头分子(ionizing calcium-binding adaptor molecule，Iba)-1免疫荧光染色评价小胶质细胞活化程度。多因子检测海马匀浆肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白介素(interleukin，IL)-5、IL-10和IL-13含量。在DHCA组和CIRP-/-组中各随机选取三个样本进行转录组学测序。qPCR检测海马组织Brd2mRNA表达量。WesternBlot检测各组海马匀浆和BV2细胞裂解中CIRP、Brd2、NF-κB-p65、IκBα的蛋白含量。免疫荧光观察各组海马区和BV2细胞CIRP与Brd2的表达与分布。Elisa法检测BV2细胞裂解液和上清培养液TNF-α含量。MTT检测各组BV2细胞毒性。流式细胞检测膜联蛋白V-FITC/PI标记的凋亡SHSY5Y细胞。
研究结果
野生型大鼠DHCA后CIRP表达显著增加(0.42±0.04vs0.74±0.06，P＜0.01)，伴有明显的神经炎症和神经元损伤。CIRP-/-大鼠经历DHCA后，组织损伤{病理评分(3.0，[2.0-3.0]vs1.0[1.0-1.5]，P＜0.001)、存活海马神经元(260±53vs581±51;P=0.001)和TUNEL标记阳性神经元(21±12vs4±2;P=0.007)}和小胶质细胞活化(40±4vs.13±7CA1区，P＜0.001)减轻。通过对RNA测序结果的验证，可能与抑制Brd2/NF-κB炎性通路(0.07±0.01vs0.03±0.01Brd2,0.61±0.11vs0.43±0.08NF-κB-p65和0.05±0.04vs0.21±0.09IκBα;P＜0.001，=0.014和0.003分另)，造成主要的炎性细胞因子释放减少(5.71±3.66vs1.56±0.82TNF-α，19.00±1.47vs13.71±2.05IL-5，和1.07±0.12vs0.71±0.15IL-13;P=0.031，0.001和0.002分别)有关。经历18℃OGD后BV2细胞CIRP表达明显增多(0.018±0.006vs0.036±0.003;P＜0.001)。在siRNA-CIRP处理的BV2细胞中，观察到类似的保护作用，包括减少的炎性细胞因子(73±11vs51±8细胞内TNF-α，和153±25vs67±13细胞外TNF-α;P=0.002和＜0.001分别)和降低的细胞毒性(1.58±0.15vs2.28±0.19;P＜0.001)。通过加入Brd2的抑制剂JQ1，在细胞水平进一步证实了下游的Brd2/NF-κB信号通路(0.20±0.05vs0.33±0.04Brd2,0.53±0.16vs0.56±0.14NF-κB-p65和0.85±0.26vs0.82±0.27IκBα;P=0.213，0.827和0.749分别)。此外，siRNA-CIRP转染的BV2细胞的条件培养基，能显著降低OGD后类神经元SH-SY5Y细胞的凋亡(40±8vs20±2;P＜0.001)，且加入JQ1有相似的作用(40±8vs21±1;P＜0.001)。
研究结论
DHCA期间小胶质细胞内表达增加的CIRP，可能通过Brd2/NF-κB信号通路，促进炎性细胞因子的释放而加重神经元损伤。