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目的:肾素-血管紧张素系统在诸如高血压和动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展过程中发挥着重要作用。血管紧张素II(Angiotensin II,Ang Ⅱ)是肾素-血管紧张素系统主要的活性肽物质,与内皮细胞紊乱、血管重塑以及血管炎症密切相关,促进高血压和动脉粥样硬化的进程。他汀类药物如阿托伐他汀能够通过维持内皮细胞功能、抗氧化应激和促进血管一氧化氮的释放进而发挥抗高血压的作用。凋亡是一种进化上保守的机制,能够通过两种途径被激活,即内源性途径和外源性途径。内源性途径即线粒体依赖途径,细胞内外多种刺激因素能够触发凋亡信号,最终传递至线粒体。细胞凋亡涉及多个基因和细胞器的调控。在2006年,Terman等人提出溶酶体-线粒体轴理论,目前关于这一理论在凋亡中的作用研究较少。本研究主要探讨Ang Ⅱ能否通过溶酶体-线粒体轴促进人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡,以及阿托伐他汀能否通过稳定溶酶体来抵抗Ang Ⅱ诱导的内皮细胞凋亡。研究方法:1、培养HUVECs,分别用不同浓度(0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM)的Ang Ⅱ处理细胞不同时间(0h、12 h、24 h、48 h和72 h)。再用0μM、1μM、10μM、20μM和50μM浓度的阿托伐他汀和1μM Ang Ⅱ共同处理细胞24h。MTT实验观察细胞活力,筛选合适药物浓度用于后续试验。2、使用1μM Ang Ⅱ和10μM阿托伐他汀处理HUVECs 24 h,Hoechst 33342染色实验、AO/EB染色实验和流式细胞术检测细胞凋亡。3、使用1μM Ang Ⅱ和10μM阿托伐他汀处理HUVECs 24 h,用Western blot检测凋亡相关蛋白caspase 3(前体和活性体)、caspase 9(前体和活性体)、Bax、Bad和Bcl-2的表达水平。4、使用1μM Ang Ⅱ和10μM阿托伐他汀处理HUVECs 24 h,TMRE染色实验和DCFH-DA染色实验分别检测线粒体膜电位和细胞内活性氧簇的改变。5、使用1μM Ang Ⅱ和10μM阿托伐他汀处理HUVECs 24 h,AO染色实验和Lysotracker染色实验检测溶酶体膜透化情况。6、使用1μM Ang Ⅱ分别处理HUVECs 0 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h和24 h,分别提取细胞总蛋白和细胞质蛋白,用Western blot检测组织蛋白酶D(CTSD)和细胞色素c的表达水平。7、使用胃蛋白酶抑制剂A抑制CTSD活性,用1μM Ang Ⅱ和10μM阿托伐他汀处理HUVECs 24 h,用CTSD酶活性试剂盒检测CTSD酶活性,用Lysotracker染色实验检测溶酶体膜稳定性,用TMRE染色实验检测线粒体膜电位,用DCFH-DA染色实验检测细胞内活性氧簇,用AO/EB染色实验和流式细胞术实验检测细胞凋亡,用Western blot检测凋亡相关蛋白caspase 3(前体和活性体)、caspase 9(前体和活性体)、Bax、Bad、Bcl-2和细胞色素c的表达水平。8、构建敲除CTSD的HUVECs细胞株(siCTSD),用Western blot检测CTSD的蛋白表达水平,用试剂盒检测CTSD酶活性。构建稳定过表达CTSD的HUVECs细胞株(CTSD-WT)和稳定过表达去除酶活性的CTSD突变体的HUVECs细胞株(CTSD-D295N),用Western blot检测CTSD的蛋白表达水平,用试剂盒检测CTSD酶活性9、使用空载体对照组细胞和成功敲除CTSD的病毒转染细胞,用1μM Ang Ⅱ和10μM阿托伐他汀处理HUVECs 24 h,用Lysotracker染色实验检测溶酶体膜稳定性,用TMRE染色实验检测线粒体膜电位,用DCFH-DA染色实验检测细胞内活性氧簇,用AO/EB染色实验和流式细胞术检测细胞凋亡,用Western blot检测凋亡相关蛋白caspase 3(前体和活性体)、caspase 9(前体和活性体)、Bax、Bad、Bcl-2和细胞色素c的表达水平。10、使用空载体对照组细胞、CTSD-WT细胞和CTSD-D295N细胞,用1μM Ang Ⅱ处理24 h,用Lysotracker染色实验检测溶酶体膜稳定性,用TMRE染色实验检测线粒体膜电位,用DCFH-DA染色实验检测细胞内活性氧簇,用AO/EB染色实验检测细胞凋亡。结果:1、阿托伐他汀能够削弱Ang Ⅱ诱导的HUVECs凋亡。2、阿托伐他汀能够削弱Ang Ⅱ诱导的HUVECs线粒体功能紊乱。3、阿托伐他汀能够削弱Ang Ⅱ诱导的HUVECs溶酶体膜透化。4、Ang Ⅱ诱导的线粒体功能紊乱位于溶酶体透化作用下游。5、药物抑制CTSD酶活性能够削弱Ang Ⅱ诱导的线粒体紊乱和凋亡。6、基因敲除CTSD能够削弱Ang Ⅱ诱导的线粒体紊乱和凋亡。7、过表达CTSD对HUVECs线粒体紊乱和凋亡无影响。结论:1、Ang Ⅱ能够通过溶酶体-线粒体轴诱导HUVECs凋亡,首先引起溶酶体膜稳定性下降,导致溶酶体内大量水解酶释放到细胞质中,其中CTSD发挥重要作用,能够引起线粒体功能紊乱,激活caspase 3和caspase 9,触发凋亡级联反应,最终引起HUVECs凋亡。2、阿托伐他汀能够通过稳定溶酶体膜,减少CTSD的释放,从而减轻线粒体功能紊乱,减少caspase 3和caspase 9的激活,削弱Ang Ⅱ诱导的凋亡。