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研究背景及目的:泛素化是真核生物的许多生物进程翻译后修饰的的关键调控蛋白。它在蛋白质的定位、代谢、调控和降解中起着重要的作用。在蛋白质的泛素化中,其底物特异性,主要是通过E3泛素连接酶(E3)来决定。RNF6(Ring Finger protein 6)属于环指蛋白家族,具有E3连接酶的功能,PBX1是RNF6的上游基因,通过特定的PRE结构域调控RNF6的表达。已有研究证实,PBX1/RNF6与前列腺癌、白血病等疾病的发生发展有着重要的联系。而迄今,对PBX1/RNF6轴与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)发生发展的关系的研究仍知之甚少。在本研究中,我们首先检测了 PBX1及RNF6在非小细胞肺癌病人肿瘤组织和癌旁组织中的表达,以及其在肺癌细胞株中的表达。进一步利用质粒过表达系统和shRNA干扰技术,分析PBX1及RNF6在非小细胞肺癌中的作用,以期阐述PBX1/RNF6轴在非小细胞肺癌中的相关功能及其机制,为临床上治疗非小细胞肺癌提供新的靶点。方法:1.选取2012年至2016年的45对非小细胞肺癌病人的肿瘤组织和癌旁组织样本,采用蛋白免疫印迹(Western Blot)、逆转录PCR的方法,比较非小细胞肺癌病人肺癌组织样本及癌旁组织样本中PBX1及RNF6蛋白表达水平差异,并通过灰度分析做出直观的对比图;2.在肺癌细胞株H1299,H460,A549中转染PBX1或RNF6质粒,通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)实验,探索过表达PBX1/RNF6对非小细胞肺癌细胞株增殖能力及顺铂的药物效应影响;3.在肺癌细胞株H1299,H460,A549中转染shRNAs敲低PBX1或RNF6表达,通过MTT实验,探索敲低PBX1或RNF6对NSCLC细胞株增殖能力及顺铂的药物效应影响;4.在肺癌细胞株H1299中转染PBX1/RNF6质粒或shRNF6,以过表达或敲低PBX1或RNF6表达,采用流式细胞术,检测过表达或敲低PBX1或RNF6对NSCLC细胞周期的影响;5.在肺癌细胞株H1299,H460中转染PBX1或RNF6质粒,通过蛋白免疫印迹、逆转录PCR的方法,检测过表达RNF6对细胞周期相关蛋白CCND2,p-Rb蛋白表达水平的变化;6.在肺癌细胞株H1299中转染PBX1/RNF6质粒或shRNF6质粒,通过划痕实验,检测过表达或敲低RNF6对肺癌细胞株细胞迁徙的影响;7.在肺癌细胞株H1299中共转RNF6和CCND2的质粒,利用免疫共沉淀方法(Co-IP),检测RNF6的泛素化情况。结果:1.Western bolt结果显示,24例病人中,22(91.7%)例病人肺癌组织中PBX1的蛋白表达水平低于癌旁组织,22(91.7%)例病人肺癌组织中RNF6的蛋白表达水平低于癌旁组织。逆转录PCR结果显示,18例病人中,15(83.3%)例病人肺癌组织中RNF6的mRNA表达水平低于癌旁组织。对45对肿瘤组织及癌旁组织的Western bolt的灰度分析显示,PBX1及RNF6在肿瘤组织中的表达水平明显低于癌旁组织(P<0.001);2.过表达PBX1或RNF6后,对NSCLC细胞的增殖有明显的抑制作用。表明,PBX1/RNF6可能与非小细胞肺癌的发生发展密切相关。同时,过表达PBX1可以明显降低非小细胞肺癌细胞株中顺铂的IC50浓度,增强药物敏感性,并能上调A549和H1299细胞中RNF6的蛋白水平。而相反,敲低PBX1/RNF6提高了非小细胞肺癌细胞株中顺铂的IC50浓度,并增强药物耐药性。提示,PBX1/RNF6还可能与NSCLC细胞的耐药性相关;3.过表达PBX1/RNF6的H1299细胞,划痕愈合明显比对照细胞慢,说明PBX1/RNF6还影响着非小细胞肺癌的迁徙能力;4.过表达PBX1/RNF6,NSCLC细胞的细胞周期被阻滞在G1/G0期,反之可以促进其进入S期,并使细胞周期相关蛋白CCND2,p-Rb呈下降趋势。提示着,PBX1/RNF6可以抑制非小细胞肺癌的细胞周期进程;5.RNF6可以促进周期蛋白CCND2的泛素化。通过泛素蛋白酶体途径,使CCND2的蛋白水平下降。进一步说明,RNF6可以抑制非小细胞肺癌的细胞周期进程。结论:PBX1、RNF6在非小细胞肺癌病人肿瘤组织中低表达。调节PBX1/RNF6轴,可以抑制非小细胞肺癌的增殖、迁徙,降低非小细胞肺癌细胞株中顺铂的IC50浓度,增强药物敏感性,并能阻滞细胞周期在G1/G0期。研究结果,将有助于为临床非小细胞肺癌的治疗提供新的策略。