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前言脑胶质细胞瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤,约占成人原发性颅内肿瘤的50%～60%。在治疗上,以手术治疗为主,因肿瘤浸润性生长,多数肿瘤与正常脑组织无明确的界限,不能彻底切除,因而术后多需要进行放射治疗、化学治疗等多种辅助疗法。由于恶性肿瘤的生物学特性,即使进行了综合治疗,脑胶质瘤术后复发几乎也是不可避免的。TOR(target of rapamycin,雷帕霉素靶蛋白)最初是1991年在酵母的突变株TOR1-1和TOR2-1中被发现。1994年,Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因,其产物只有一种蛋白,即mTOR(mammaliantarget of rapamycin,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,也被称为FRAP、RAFT、RAPT)。人mTOR基因定位于1p36.2,编码的蛋白质由2549个氨基酸组成,分子量是280kDa。研究表明mTOR在细胞的增殖、生长、分化过程中起着中心调控点的作用。此外,相关研究证实其在肿瘤的形成、发展过程,也起着重要作用。本实验采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及western blot的方法探讨mTOR的表达与脑胶质瘤的恶性程度或组织学分级的关系。实验材料选择选取中国医科大学第一临床学院神经外科2006年12月至2007年6月间手术切除的人脑胶质瘤组织标本35例,其中男21例,女14例,年龄20～74岁,平均年龄46岁。根据WHO(2001年)关于人脑胶质瘤病理分类方法:包括Ⅰ级6例,Ⅱ级15例,Ⅲ级9例,Ⅳ级5例。所有患者术前均未接受放疗、化疗或其他任何可能对肿瘤生物学特性的干预性治疗。主要试剂:PCR引物(大连宝生物公司);DNA分子量标准(大连宝生物公司);硝酸纤维素膜(美国Millipore公司);兔抗人mTOR(美国Biochemicals公司);碱性磷酸酶标记的山羊抗兔二抗(北京中山公司);鼠抗β-actin(美国Sigma公司)等。主要仪器:高速冷冻离心机(Sigma 3C15K美国);PCR仪(Biometra UnioⅡ型,德国);多功能电泳仪(北京六一仪器厂);紫外分光光度计(UV3000,英国);凝胶自动成像及分析系统(Chemi Imager,美国);转印电泳槽(北京六一仪器厂)等。实验方法1、RT-PCR采用Trizol试剂一步法提取组织总RNA,紫外分光光度计测定纯度并定量。根据GenBank提供的mTOR和内参照β-actin的mRNA序列,应用软件PrimerPremier 5.0自行设计引物。反应条件:94℃5min,一个循环;94℃,30s,55℃30 s,72℃1min,35个循环;72℃5min后结束扩增反应。取PCR产物与上样缓冲液混合,进行2%琼脂糖凝胶电泳,120V,30min,电泳结束后,凝胶成像仪成像分析。2、Western blot提取样品蛋白,进行样品蛋白定量并进行浓度调整,电泳,转印,用抗mTOR抗体和抗β-actin抗体孵育,最后加入碱性磷酸酶标记的相应二抗,加入显色剂显色后记录结果,并用凝胶成像仪分析图像。3、统计学分析凝胶图像分析系统进行灰度分析,mTOR基因的表达值以(mTOR的光密度值/β-actin吸光度值)×100%表示,结果以(?)±s表示。应用SPSS13.0软件进行统计分析,两组间均数比较采用t检验,两样本率的比较用X~2检验,p＜0.05有统计学意义。实验结果本研究结果显示:30例人脑胶质瘤样本中有mTOR的mRNA以及蛋白的表达,Ⅰ级,Ⅱ级,Ⅲ级,Ⅳ级胶质瘤组织中mTOR的表达率无显著性差异。随肿瘤恶性程度的增高mTOR的mRNA以及蛋白的表达均有所增高,Ⅰ级,Ⅱ级,Ⅲ级,Ⅳ级胶质瘤中组织中mTOR的mRNA以及蛋白表达值相互比较,差异显著(p＜0.01)。讨论胶质瘤的发病机制非常复杂,很多基础研究期望从基因水平寻求治疗胶质瘤的突破口。mTOR是近年来发现的一类进化上非常保守的蛋白激酶家族,广泛存在于各种生物细胞中。最近对其复合物功能的研究对肿瘤和代谢性疾病的发病机制提供了合理的解释。既往研究表明,在多数肿瘤组织中mTOR高表达,如前列腺癌、乳腺癌、肝癌、腮腺癌、胆管癌以及白血病等。以上研究结果提示mTOR高表达可能与肿瘤形成和细胞增殖活跃密切相关。本实验结果表明,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR在人脑胶质瘤组织中基因及蛋白水平的表达值增高,并且随肿瘤恶性程度的增高mTOR的mRNA以及蛋白的表达值均有所增高,Ⅰ级,Ⅱ级,Ⅲ级,Ⅳ级胶质瘤中组织中mTOR的mRNA以及蛋白表达值相互比较,差异显著(p＜0.01)。雷帕霉素及其衍生物作为mTOR特异性抑制剂在肿瘤治疗中的作用已引起广泛关注,其中关于前列腺癌、乳腺癌、胃肠道间质的肿瘤治疗研究已进入Ⅰ期及Ⅱ期临床实验。因此对mTOR的深入研究可能有助于丰富胶质瘤发生发展机制,并为胶质瘤的治疗提供新的思路。结论1、mTOR在人脑胶质瘤中的表达上调。2、mTOR的表达上调可能参与了胶质瘤的发生及发展。3、随着胶质瘤恶性程度的增高,mTOR的表达也随之上调。