自20世纪40年代青霉素发明以来,抗生素在全球范围内被广泛的应用于人类医学、畜牧养殖以及水产养殖业,用于细菌性疾病防治及治疗。随着禽畜和水产养殖业的高速发展,兽用抗生素的消耗量已经远远超出医用抗生素。抗生素的持续过量使用,不仅威胁养殖生物作为食品源的安全性,造成生态环境污染,同时,在抗生素的这种持续选择性压力的作用下,容易诱发大量抗生素耐药菌的产生。本文选取了山东三个刺参主养区进行了苗期海参肠道耐药菌筛选及耐药基因的调查,并对筛选的菌株进行了16S rDNA分析,初步揭示了刺参肠道耐药菌及耐药基因的存在现状。采用体外人工诱导技术,对哈维氏弧菌、美人鱼发光杆菌进行耐药性诱导,验证弧菌对抗生素耐药性的可诱导性。对获得的人工诱导的耐药菌株的最低抑菌浓度(MIC)变化、耐药菌谱变化及抑菌后细菌反应特性等方面进行监测和分析,并对耐药性探究其生物学特性转变的机制。1、山东主要刺参养殖区幼参肠道抗生素耐药菌及耐药基因分布特征对采自烟台、威海、青岛3个刺参主要养殖区6家养殖场的幼参肠道中常用抗生素的耐药菌数量、占比和种类进行检测,同时利用荧光定量PCR技术,对这些样本中4类抗生素的7种耐药基因的分布情况进行分析。结果表明,所检测的6个采样点中均有6种抗生素耐药菌的检出,从耐药菌占比来看,耐药菌占比最高的种类是乙酰甲喹、萘啶酸和四环素耐药菌,占比分别为0.05%~40.06%、2.16%~39.94%、0.06%~23.15%,氟苯尼考、庆大霉素和链霉素耐药菌的占比均不高,占比范围为0.01%~4.15%。对所分离到的98株耐药菌的鉴定结果可以看出,可培养的抗生素耐药菌分为4门5纲30属,主要集中在弧菌属、芽孢杆菌属和嗜冷杆菌属,占检出率的15.30%、13.27%和12.25%。根据基于属水平的不同抗生素耐药菌种类的分布统计结果表明,各采样点耐药菌种类差异较大,而且弧菌属、芽孢杆菌属和嗜冷杆菌属中均存在同一菌属中有耐多种抗生素的情况。对6个样本7种抗生素耐药基因的丰度检测结果显示,同一类抗生素的不同耐药基因的含量差异显著,除氨基糖苷类抗生素耐药基因aadA的相对拷贝数比例和链霉素以及庆大霉素耐药菌之间存在显著相关性(p<0.05)外,其他抗生素耐药基因的丰度与耐药菌占比之间相关性不显著(p>0.05)。以上结果说明苗期刺参中存在一定的携带耐药菌和耐药基因的风险。2、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)耐药性的人工诱导及其相关生物特性分析对实验室分离的鱼源美人鱼发光杆菌进行耐药性诱导,根据药敏结果,选取该菌敏感的氟苯尼考和氧氟沙星作为诱导抗生素。敏感菌株对氟苯尼考和氧氟沙星的初始抑菌圈直径分别为25mm和21mm,对氟苯尼考和氧氟沙星的最低抑菌浓度分别为0.125μg/mL、0.25μg/mL。采用MIC逐步诱导法对美人鱼发光弧菌进行人工诱导,每20h算作一代,连续诱导30代。诱导期间,每六代进行一次最小抑菌浓度(MIC)测定,根据测定结果调整诱导药物的浓度,使其浓度始终维持在MIC水平;每六代测定一次药敏谱(共38种抗生素),监测其药敏谱的变化规律。诱导后,测定人工诱导菌株的生长曲线及抑菌后生长曲线,与敏感菌株对比差异。结果发现,诱导后的氟苯尼考耐药株(M-FF)对氟苯尼考的MIC提高到8.0μg/mL,提高64倍,氧氟沙星耐药株(M-OF)对氧氟沙星的MIC提高到1.0μg/mL,提高了4倍,初步得到成功诱导的耐药菌株。药敏谱结果显示,M-FF对氟苯尼考的抑菌圈直径由25mm减小到19mm,耐药性由“敏感”转变为“中介”;M-OF对氧氟沙星的抑菌圈直径由21mm减小到12mm,耐药性由“敏感”转变为“耐药”。诱导前后生长曲线结果显示,诱导株M-OF相对于敏感菌株,进入平台期的时间推后了2h,但进入平台期后的活菌数量无差别;M-FF与敏感菌株在活菌数量及进入平台期的时间等方面均无明显差异。抑菌后细菌的生长曲线测定显示,诱导株M-OF对药物的敏感性降低,经抑菌处理除去药物2h后,其生长速度最快、强度最大,明显高于敏感菌株;诱导株M-FF经抑菌处理后,生长强度与敏感菌株差异不大,但生长速度仍高于敏感株。说明美人鱼发光杆菌在体外经过抗生素的持续性刺激是可以被诱导产生耐药性,且耐药菌对药物的敏感性明显降低,与药物接触后生长速度均超过抗生素敏感菌。3、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)耐药性的人工诱导及其相关生物特性分析对实验室分离的鱼源哈维氏弧菌进行耐药性诱导,根据药敏结果,选取该菌敏感的氟苯尼考和氧氟沙星作为诱导抗生素。敏感菌株对氟苯尼考和氧氟沙星的初始抑菌圈直径分别为30mm和20mm,对二者的最低抑菌浓度分别为0.5μg/mL、2.0μg/mL。采用MIC逐步诱导法对哈维氏弧菌进行人工诱导,每20h算作一代,连续诱导30代。诱导期间,每六代进行一次最小抑菌浓度(MIC)测定,根据测定结果调整诱导药物的浓度,使其浓度始终维持在MIC水平;每六代测定一次药敏谱(共38种抗生素),监测其药敏谱的变化规律。诱导后,测定人工诱导菌株的生长曲线及抑菌后生长曲线,与敏感菌株对比差异。结果发现,诱导后的氟苯尼考耐药株(H-FF)对氟苯尼考的MIC提高到32μg/mL,提高64倍,氧氟沙星耐药株(H-OF)对氧氟沙星的MIC提高到8μg/mL,提高了4倍,初步得到成功诱导的耐药菌株。药敏谱结果显示,H-FF对氟苯尼考的抑菌圈直径由30mm减小到17mm,耐药性由“敏感”转变为“中介”;H-OF对氧氟沙星的抑菌圈直径由20mm减小到0mm,耐药性由“敏感”转变为“耐药”。诱导前后生长曲线结果显示,诱导株H-FF相对于敏感菌株,进入平台期的时间推后了2h,但进入平台期后的活菌数量无差别;H-OF与敏感菌株在活菌数量及进入平台期的时间等方面均无明显差异。抑菌后细菌的生长曲线测定显示,诱导株H-FF对药物的敏感性降低,经抑菌处理除去药物后,其生长速度和强度均高于敏感菌株;诱导株H-OF经抑菌处理后,生长强度与敏感菌株差异不大,但生长速度仍高于敏感株。说明哈维氏弧菌在体外经过抗生素的持续性刺激是可以被诱导产生耐药性,且耐药菌对药物的敏感性明显降低,与药物接触后生长速度均超过抗生素敏感菌。4.哈维氏弧菌敏感菌和氧氟沙星耐药菌转录组分析随着高通量测序技术迅猛发展,测序技术不断的更新换代,转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)已经取代微阵列成为强大的分子分析工具。利用RNA测序技术可以对数以千计的基因同时进行表达水平的检测,从而对生物过程中的代谢途径以及调节方式进行分析。本研究利用二代测序技术对哈维氏弧菌的敏感菌株和经氧氟沙星诱导的耐药株进行转录组测序,探究诱导前后哈维氏弧菌在转录组水平的变化,结果显示,得到了602个差异表达基因,其中氧氟沙星诱导的哈维氏弧菌耐药菌株与敏感菌株相比有314个基因表达上调,288个基因表达下调,其中4个基因仅在耐药菌株中表达。GO注释中,生物过程方面差异表达基因主要富集在移动(locomotion)、生物黏附(biological adhesion)和碳水化合物利用率(carbohydrate utilization)。COG分类主要集中在氨基酸转运和代谢、碳水化合物转运和代谢、无机离子运输与代谢、转录、翻译后修饰及蛋白质转换、细胞壁/膜生物合成和细胞运动。KEGG通路富集结果表明双组份系统(ko02020)、ABC转运系统(ko02010)、鞭毛组装(ko02040)、嘌呤代谢(ko00230)和氧化磷酸化(ko00190)等通路注释到的差异基因数最多,并且显著富集。