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[目的]microRNA-218(miR-218)是一种重要的抑瘤微小RNA(miRNA),其表达异常可见于多种实体肿瘤及癌前病变。本室前期研究发现胶质瘤miR-218表达水平随其良恶性程度升高而相应降低,提示其表达减少或缺失可能在胶质瘤发生、发展中起到重要作用。生物信息学预测显示细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)是miR-218的潜在靶基因,且胶质瘤CDK6表达水平随其良恶性程度升高而相应增加,但在胶质瘤细胞中二者表达变化的确切关系如何,尚待进一步证实。本研究旨在观察miR-218在恶性胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及诱导细胞成熟分化方面的作用,证实CDK6是否miR-218的天然靶基因,探讨miR-218特异性敲低CDK6表达是否是该miRNA发挥抑瘤作用的分子机制。[方法]①通过质粒转染和G418筛选建立过表达miR-218的U87MG和SNB-19亚细胞系及对照亚细胞系,采用stem-loop qRT-PCR比较各亚细胞系中miR-218的表达水平。②采用荧光素酶实验、qRT-PCR及Western blot验证CDK6是否是miR-218的天然靶基因,探讨miR-218敲低CDK6表达的机制。③利用Ki-67免疫细胞化学染色及克隆形成实验比较各亚细胞系细胞增殖活性,通过流式细胞术(FCM)和cyclin D1、cyclin E、cyclin A、CDK4、CDK6等细胞周期调节蛋白的Western blot检测比较各亚细胞系细胞周期分布情况,分析miR-218诱导细胞周期阻滞和增殖抑制的分子机制。④通过Caspase3/7活性检测及FCM比较miR-218过表达亚细胞系及miR-218mimics转染细胞凋亡水平的改变,通过质粒转染补充外源性CDK6,观察CDK6对miR-218促凋亡作用的影响,以进一步验证miR-218特异性下调CDK6表达在其促凋亡作用中的意义。⑤利用体外迁移侵袭实验、Matrigel3D培养及定量侵袭实验比较miR-218表达水平不同亚细胞系迁移侵袭能力的差异,通过补充外源性CDK6探讨特异性敲低CDK6是否是miR-218抑制肿瘤细胞迁移侵袭的分子机制。⑥利用Western blot及免疫细胞化学染色检测不同亚细胞系CD133、Nestin及GFAP表达的差异,观察miR-218在恶性胶质瘤细胞系及胶质瘤干细胞(GSCs)成熟分化中的作用；利用免疫荧光观察miR-218下调CD133及Nestin表达的特异性；通过观察补充外源性CDK6对miR-218促分化作用的影响探讨特异性敲低CDK6是否是miR-218促进肿瘤细胞成熟分化的分子机制。[结果]①成功构建了过表达miR-218的U87MG及SNB-19胶质母细胞瘤亚细胞系,并经stem-loop qRT-PCR证实其miR-218的表达量分别是对照亚细胞系的11.58±2.39倍及26.23±8.08倍。②荧光素酶实验结果显示,miR-218可通过与荧光素酶mRNA下游连接的CDK63’UTR结合,特异性降低荧光素酶的表达水平,证实CDK6是miR-218的天然靶基因；qRT-PCR及Western blot结果显示,miR-218过表达亚细胞系CDK6mRNA及蛋白表达水平均明显低于对照亚细胞系。③miR-218过表达亚细胞系Ki-67阳性标记指数(LI)和克隆形成效率均明显低于对照亚细胞系,其cyclin D1表达水平明显高于对照亚细胞系,cyclin E、 cyclin A表达水平明显低于后者,而CDK4的表达水平无明显差异；FCM结果显示,miR-218过表达亚细胞系G1期细胞比例增高,而S期及G2／M期细胞比例相应减少。④miR-218过表达亚细胞系Caspase3/7活性明显高于对照亚细胞系,miR-218mimics转染的U87MG及SNB-19细胞其凋亡指数明显高于无义对照序列转染细胞。外源性CDK6不能降低miR-218过表达亚细胞系的Caspase3/7活性及miR-218mimics转染细胞的凋亡指数。⑤迁移、侵袭实验结果及3D培养结果均显示,miR-218可有效抑制胶质母细胞瘤细胞系的迁移和侵袭能力,外源性CDK6可部分逆转miR-218对肿瘤细胞迁移侵袭的影响。⑥miR-218过表达亚细胞系中CD133及Nestin表达水平明显低于对照亚细胞系,而GFAP LI (?)明显高于后者。外源性CDK6可部分逆转miR-218过表达造成的上述蛋白的表达变化；免疫荧光检测显示,CD133和Nestin表达降低特异性地发生于成功转染miR-218表达质粒且表达EGFP报导基因的肿瘤细胞。[结论]①本研究建立的miR-218过表达亚细胞系可稳定高表达miR-218。②CDK6是miR-218的天然靶基因,miR-218可通过降解其mRNA和阻断其翻译过程在转录后和翻译两个水平特异性敲低CDK6的表达。③CDK6是易化恶性胶质瘤细胞G1／S过渡的重要激酶,miR-218可通过敲低CDK6表达诱导G1期阻滞,并进而抑制恶性胶质瘤细胞的增殖活性。④miR-218可诱导恶性胶质瘤细胞的凋亡,但该作用与其阻断CDK6表达无关。⑤miR-218可有效抑制恶性胶质瘤细胞的迁移和侵袭,CDK6表达下调是miR-218抑制迁移侵袭的机制之一。⑥miR-218可诱导恶性胶质瘤细胞及GSCs的成熟分化并抑制GSCs干细胞表型的表达；特异性敲低CDK6是miR-218诱导肿瘤细胞成熟分化的机制之一