目的:采用新一代测序技术DGE进行转录组测序,分析中药黄药子水提取物诱导小鼠肝损伤后的基因表达谱,探究黄药子中毒导致肝损伤的作用机制,并结合文献分析,寻找可能的解毒中药复方。方法:1.肝损伤模型建立:SPF级雌性昆明小鼠40只,6周龄,体重(20±2)g,按随机数字表法分为4组,每组10只。黄药子干预组小鼠分别以低(6 g/kg/d)、中(12 g/kg/d)、高(24 g/kg/d)剂量的黄药子水提取物连续灌胃21 d,正常对照组以同体积生理盐水灌胃。通过对比观察4组小鼠的体重增长值、肝脏指数、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸转移酶(AST)活性以及肝组织经苏木精-伊红(HE)染色后的病理变化,确定可引起小鼠明显肝损伤的给药剂量。2.DGE文库信息分析和qRT-PCR法验证:根据前期研究成果,利用RNA-seq技术(RNA sequencing)分别构建黄药子诱导组(DB组)和对照组(Normal组)小鼠肝脏的数字化基因表达谱(DGE)文库,对比两个DGE文库的差异表达基因,并进行基因本体论(GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。最后筛选出各代谢通路中有代表性的差异表达基因,采用qRT-PCR法进行显著性验证。3.文献分析:通过文献检索,找出具有拮抗黄药子诱导的药物性肝损伤的功效的中药;检索和分析各个解毒中药的化学成分及其保肝护肝的作用机制,并探讨其主要活性成分对前期研究已证实的相关信号通路的调节作用。结果:1.与对照组相比,仅高剂量组小鼠出现明显的肝损伤,表现为同时存在体重增长值降低、肝脏指数增高、ALT及AST活性增高(P<0.05)、肝组织病理变化明显(结构明显破坏、肝索受压紊乱、肝细胞明显肿胀且呈气球样变性、肝小叶内中性粒细胞浸润以及肝细胞变性明显(P<0.01)。2.以高剂量组小鼠为DB诱导组,对照组为Normal组,分别测序并构建肝组织的DGE文库:两组分别检测出13 214 893和11 124 617条碱基序列(raw reads),过滤并剔除带有接头、带有N碱基和测序质量低的reads后分别得到12 819 933和10 786 300条序列(cleanreads)。根据所得的两组DEG文库,对比筛选出了 312个显著差异表达的基因,其中上调基因148个,下调基因164个。对两组差异表达基因进行聚类分析:两组均表达的高质量序列有9537个,仅在DB组表达的有702个,仅在Nomal组表达的有539个。GO功能注释主要归类为生物学过程和分子功能两个分支。根据KEGG通路分析结果,差异表达的基因主要涉及8条通路:视黄醇代谢通路、花生四烯酸代谢通路、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)信号通路、细胞色素P450(CYP450)酶代谢通路、CYP450酶催化的外源物质代谢通路、甾类激素生物合成通路、谷胱甘肽代谢通路、不饱和脂肪酸的生物合成过程。经qRT-PCR验证,相比对照组,黄药子诱导组有6个基因表达上调,其中5个基因(CD36、SCD2、CYP2E1、CYP3A44、CYP4A)的差异表达具有显著性意义(P<0.05),GST的差异表达无显著性意义;此外,GPX的基因表达相较对照组显著下调(P<0.05)。3.常用作黄药子肝毒性解药的中药包括甘草、当归、黄芩、黄柏、五味子、蜈蚣藻、半枝莲等,尤以甘草、当归最为常用。其所含的活性成分,均可通过拮抗黄药子致肝损伤的不同信号通路,降低肝脏损伤程度,发挥保肝护肝的功效。结论:黄药子中毒致肝损伤的作用机制可概括为:①影响花生四烯酸代谢通路,破坏肝细胞内和线粒体中钙离子的稳态,破坏线粒体功能,引起细胞凋亡;②诱导PPAR信号通路中的多种CYP4A酶同工酶、CD36、SCD2基因的表达,促进自由基产生,从而导致肝损伤;③影响CYP450酶的代谢,使药物在肝内代谢后产生有毒性的代谢产物;④直接影响谷胱甘肽依赖性抗氧化酶的活性而引起机体氧化应激损伤。基于抗氧化特性和对CYP450酶的调控,甘草、当归、黄柏、黄芩、五味子、蜈蚣藻、半枝莲均具有拮抗黄药子的肝毒性的功效。可将这些功效相似,但性味不一致的不同中药可组成一个复方,用于治疗黄药子诱导的肝不良反应。