研究背景近年来,随着我国逐步步入老龄化社会以及雾霾的加重,致使肺纤维化的发病率以每年11%的比例逐年上升,中国肺纤维化患者保守估计超过100万。目前,肺纤维化的发病机制不清,治疗方面无确切有效的药物,一旦确诊为特发性肺纤维化,患者中位生存期大约3-5年。因此,肺纤维化的治疗仍属世界性难题。2014年FDA批准了两种相对有效的抗肺纤维化药物:吡非尼酮和尼达尼布。这两种药物虽给肺纤维化患者带来了希望,但治疗效果也仅限于减缓肺功能的恶化,尚不能明显延长患者的生存时间,同时其应用过程中伴随严重的不良反应,如皮疹,胃肠道反应,肝功异常,高血压等。目前临床上常用的治疗药物仍以西药为主,如糖皮质激素、免疫抑制剂、抗氧化剂等。但是这些化学药物的疗效存在争议。因此深入研究肺纤维化的发病机制,寻找有效防治肺纤维化的药物,具有重要的临床应用价值和深远的社会意义。肺纤维化属于中医学“肺痹”、“咳嗽”等范畴,中医辨证属本虚标实证,虚多属肺脾气虚,实多为痰浊瘀毒互结。肺复康就是本课题组成员根据中医传统理论,结合现代医学观点,经临床反复药物筛选,取炙黄芪、党参、麦冬、五味子、三七、浙贝母、知母、炙甘草八种药材组方,提取加工后精制而成的,具有完全自主产权的纯中药制剂(批准文号:鲁药制字Z 1620030007)。组方中黄芪益气扶正为君药,甘草祛痰解毒、调和诸药为佐使,通过益气扶正、解毒祛痰、化瘀通络达到防治肺纤维化的作用。目前中药复方研究最大困惑是如何确立其作用靶点及作用机制。本研究将从蛋白组学、基因信息学及细胞生物学等方面,研究中药复方肺复康抗肺纤维化作用机制,为中药复方制剂对抗慢性复杂疾病提供关键研究线索,而且在此基础上为研发抗肺纤维化中药新药提供科学的理论依据。鉴于中药复方制剂在治疗慢性不明原因性疾病中存在的巨大优势,我们课题组将肺复康研发为抗肺纤维化中药新药,将给肺纤维化患者带来新的希望,同时也给其他中药复方的研究指出了新的思路。目的1.明确肺复康抗肺纤维化的功效。2.探索肺复康抗肺纤维化的靶向基因和作用途径。3.明确肺复康的活性药物成分及其药代动力学特性。方法1.体外实验评估肺复康抗肺纤维化效果TGF-β1刺激L929细胞以建立体外肺纤维化细胞模型,分为正常组,肺纤维化模型组,肺复康治疗组。通过实时增殖/迁移分析系统(RTCA),分析肺复康对肺纤维化细胞模型的作用。免疫荧光染色显示各组细胞中α-SMA的表达,Western blot检测各组细胞中波形蛋白、α-SMA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达水平。2.体内实验评估肺复康抗肺纤维化效果C57BL/6小鼠,随机分为正常对照组,肺纤维化模型组,肺复康治疗组。通过小鼠肺功能仪分析各组小鼠用力肺活量(FVC),评估各组小鼠FVC的差异。小鼠肺组织病理切片,进行HE和Masson染色。肺组织匀浆进行羟脯氨酸(Hyp)的测定。Western blot检测α-SMA、Collagen Ⅰ的表达量,评估肺复康抗肺纤维化效果。3.网络药理学寻找肺复康有效成分及可能参与的信号通路利用TCMID数据库、Herb BioMap数据库,收集和提取肺复康中各种药物的活性化学成分。将药物成分输入TCMSP数据库,通过ADME系统TCMSP数据库模型筛选出主要生物活性成分。通过网络药理学方法,建立三个层次的网络:复合药物网络寻找肺复康有效活性成分;复合靶点网络寻找肺复康有效活性成分对应的作用靶点;靶点-路径网络反映肺复康抗肺纤维化可能的作用靶点和相应的目标信号通路。将口服生物利用度(OB)>10%,类药性(DL)>0.04作为进一步提取和优化药物成分的阈值,进一步筛选生物活性化合物。为了将其可视化,网络分析通过评估节点的度(degree)来表示。4.高通量RNA测序(RNA sequence)进一步揭示肺复康抗肺纤维化的作用机制收集各实验组小鼠肺组织,进行总RNA提取并纯化后,进行RNA sequence。评估三组之间差异表达的mRNA。通过GO和KEGG分析进一步整理差异表达的mRNA,寻找参与的信号通路。实时定量PCR(qRT-PCR)再次确认差异表达的mRNA。Western blot检测差异表达的mRNA对应的蛋白,验证肺复康抗纤维化的JAK-STAT信号通路。Western blot检测STAT3、JAK1、smad3相对应的磷酸化蛋白,证明蛋白磷酸化参与了 JAK-STAT信号通路的作用。利用lncRNA测序数据,分析JAK-STAT信号通路中共表达的lncRNA,为后期的多靶点研究提供基础。5.U-HPLC-MS/MS分析肺复康主要活性成分及其药代动力学特性采用超高效液相色谱串联质谱分析技术(U-HPLC-MS/MS),比对了肺复康与对照品的保留时间、一级及二级质谱数据,从而确定肺复康的主要活性成分。肺纤维化模型小鼠在肺复康灌胃之前,从眶下静脉采集血液,并在治疗后0.08,0.17,0.33,0.5,0.75,1,1.5,2,3,4,6,8,12 和 24 小时收集血液,用 U-HPLC-MS/MS技术检测肺复康各活性成分在不同时间点的浓度,获取其药代动力学特性。结果1.肺复康在体外有抗肺纤维化作用。肺复康能抑制肌成纤维细胞的活化,使TGF-β 1诱导的L929细胞的增殖和迁移能力下降,能使I型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)和Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ)表达量相对肺纤维化模型组减少。2.肺复康可缓解肺纤维化导致的FVC下降。肺纤维化模型组的肺功能指标FVC显著降低,而肺复康治疗组小鼠的FVC较肺纤维化模型组下降减缓。3.肺复康可减轻肺组织的纤维化程度。肺复康治疗组较肺纤维化模型组,肺纤维化程度相对较轻,表现为:肺组织的肺纤维化评分低,胶原蛋白的沉积较少,肺组织中羟脯氨酸(HYP)的含量下降,肺组织中α-SMA、I型胶原蛋白的表达减少。4.复合药物网络找到了肺复康可能的有效活性成分。通过网络药理学中的复合药物网络(c-m网络),在肺复康的8个组方药物中,分析出90种生物活性化合物。其中,M05芒柄花素、M07烟酸、M66毛蕊异黄酮、M76芒果花苷,在三种草药成分中复制,而且具有高口服生物利用度(OB),可能是肺复康的主要活性化合物。5.复合靶点网络和靶点-路径网络发现了多个与肺复康作用机制相关的靶点和作用路径。网络药理学中的复合靶点网络(c-t网络)和靶点-路径网络(T-P网络),显示肺复康的90种生物活性化合物,通过914个关系对应129个潜在靶向分子。化合物和分子靶点的平均degrees分别是10.16和7.20。在这些潜在靶向分子中,有83个分子能够靶向包括JAK-STAT信号通路在内的26条肺纤维化相关的信号通路,分子靶点和信号通路的degree分别是3.35和10.30。6.JAK-STAT信号通路参与了肺复康抗肺纤维化机制。小鼠肺组织进行高通量RNA测序(RNA-Sequence),对差异基因功能富集后发现,肺复康组中有多条与JAK-STAT信号通路相关的mRNA出现了差异性表达。选取了其中代表性的JAK1,STAT3和ADAM17基因,进行qRT-PCR和基因相应蛋白的Western印迹分析,显示JAK1,STAT3和ADAM17的mRNA及蛋白表达在肺纤维化模型组中显著增加,而在肺复康治疗组表达则显著降低。7.蛋白质磷酸化可能参与了 JAK-STAT信号通路表达。Western blot方法进一步检测SMAD3,p-STAT3和p-JAKl磷酸化的蛋白表达水平。与肺纤维化模型组相比,肺复康治疗组磷酸化蛋白的表达降低。8.寻找到了JAK-STAT信号通路共表达的lncRNA。基于RNA测序数据,发现9个lncRNA可与STAT3共表达,10个lncRNA与JAK1共表达。其中,lncRNA-MSTRG7464.1 和 lncRNA-NONMMUG052541.1 与 JAK1 和 STAT3 具有最高的共表达程度,共表达度的值分别为2.13和1.9。9.进一步确定了肺复康的主要药物活性成分。采用超高效液相色谱串联质谱分析技术(U-HPLC-MS/MS),确定了肺复康的主要药物活性成分:芒果苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒果花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素,各自对应的回归方程分 别 为 Y=7.185×10-4X+8.95×10-5(r=0.9992)、Y=9.82×10-2X-6.354× 10-2(r=0.9975)、Y=4.014×10-2X+6.446×10-2(r=0.9926)、Y=6.854× 10-2 X+5.51 0× 10-2(r=0.9943)、Y=7.140× 10-2X+2.316× 10-2(r5=0.9978)。它们在0.2～50 ng/mL浓度呈良好的线性关系。芒果苷296.7μig/g、毛蕊异黄酮葡萄糖苷220.4μg/g,甘草苷、芒果花苷173.6μg/g、毛蕊异黄酮124.4μg/g、芒柄花素 50.8μg/g。10.探讨了肺复康活性成分的药代动力学特性。通过U-HPLC-MS/MS技术检测上述五种化合物在血内的保留时间分别为芒果苷2.39min、毛蕊异黄酮葡萄糖苷2.56min,甘草苷4.12min、芒果花苷5.02min、毛蕊异黄酮6.77min、芒柄花素4.12min。毛蕊异黄酮、芒果苷和芒果花苷具有较高的血清浓度(大于5.0ng/ml)。肺纤维化鼠和正常鼠相比,毛蕊异黄酮、芒柄花素和芒果苷具有差异的药物代谢参数。其中毛蕊异黄酮、芒柄花素T1/2在纤维化鼠和正常鼠中差异显著。结论1.动物体内实验及体外实验证明肺复康具有良好的抗肺纤维化作用。2.肺复康是通过多基因和多途径来起到抗肺纤维化功效的。JAK-STAT信号传导通路是肺复康抗肺纤维化的作用机制之一。3.蛋白质磷酸化和部分lncRNA可能参与了 JAK-STAT信号传导通路的表达。4.毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒果花苷和芒果苷是肺复康的主要活性成分。肺复康表现出令人满意的药代动力学性能。