【摘 要】
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衣康酸是一种不饱和的二元酸,分子内含有一个乙烯基键和两个活泼的羧基,被广泛用于轻工业、农业、医药和能源等领域。目前工业上主要利用丝状真菌土曲霉生产衣康酸,由于土曲霉对培养基成分要求严格,在发酵过程中需要持续的供氧,以及本身具有复杂的蛋白酶系统等多方面的限制,加大了衣康酸的生产成本,从而阻碍了工业上生产衣康酸的进展。本论文以具有清晰的遗传背景、适应范围广、达到GRAS级别的黑曲霉作为生产衣康酸的底盘
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衣康酸是一种不饱和的二元酸,分子内含有一个乙烯基键和两个活泼的羧基,被广泛用于轻工业、农业、医药和能源等领域。目前工业上主要利用丝状真菌土曲霉生产衣康酸,由于土曲霉对培养基成分要求严格,在发酵过程中需要持续的供氧,以及本身具有复杂的蛋白酶系统等多方面的限制,加大了衣康酸的生产成本,从而阻碍了工业上生产衣康酸的进展。本论文以具有清晰的遗传背景、适应范围广、达到GRAS级别的黑曲霉作为生产衣康酸的底盘细胞,利用土曲霉和玉米黑粉菌两种衣康酸合成途径生产衣康酸。为了进一步提高衣康酸的生产效率,通过阻断副产物的形成,加强衣康酸前体供给等策略,探索并开发了一株高效生产衣康酸的微生物细胞工厂。本论文主要研究结果如下:（1）黑曲霉S1075作为亲本菌株,利用土曲霉来源的衣康酸合成途径对黑曲霉进行遗传改造,使衣康酸能够在黑曲霉中积累。首先,通过过量表达顺乌头酸脱羧酶编码基因cadA,使黑曲霉具备合成衣康酸的能力,得到的重组菌S1361能够产生2.73 g/L的衣康酸。为了加强顺乌头酸从线粒体中向细胞质的转运,在S1361中过量表达线粒体转运蛋白Mtt A,得到的菌株S1486产生了4.08 g/L的衣康酸。为了进一步加强衣康酸转运系统,在S1486菌株基础上过量表达衣康酸膜转运蛋白Mfs A,摇瓶发酵6 d产生了4.32 g/L的衣康酸。（2）黑曲霉S1075作为亲本菌株,通过遗传改造将玉米黑粉菌来源的衣康酸合成途径整合至黑曲霉中,使黑曲霉具备合成衣康酸的能力。在黑曲霉S1075中共表达胞质-Δ-异构酶Adi1和反式-乌头酸脱羧酶Tad1,得到的重组菌S1683能够合成1.85 g/L的衣康酸。为了改善线粒体中顺乌头酸向胞质运输的渗透性,在菌株S1683中过量表达线粒体转运蛋白Mtt1,得到重组菌S1738,能够产生2.74 g/L的衣康酸。在黑曲霉S1738菌株的基础上,过量表达衣康酸膜转运蛋白Itp1;经摇瓶发酵,重组菌S2120的衣康酸滴度为3.02 g/L。（3）将土曲霉和玉米黑粉菌两种衣康酸合成途径整合至黑曲霉中,进一步促进了衣康酸的积累。对重组菌S1596和S2120进行比较,发现S1596在生产衣康酸方面更具有优势。因此,在菌株S1596中共表达adi1和tad1,得到重组菌S1779;经摇瓶发酵,黑曲霉S1779中的衣康酸滴度提高了19.68%,可以产生5.17 g/L的衣康酸。为了强化衣康酸的转运系统,在S1779中过量表达itp1,得到的重组菌S2083产生了5.58 g/L的衣康酸,是S1779菌株的1.08倍。（4）为了提高CAD的表达水平,在菌株S2083基础上增加了cadA基因的拷贝。经q RT-PCR转录分析,得到的重组菌S2209中cadA的转录水平显著提高了84.44%。同时,还发现CAD活性也相应提高,是出发菌S2083的1.66倍。经摇瓶发酵6 d,重组菌S2209产生的衣康酸相较于出发菌S2083显著提高了43.19%,得到了7.99g/L的衣康酸。为了阻断衣康酸进一步降解成为衣康酰辅酶A,在菌株S2209的基础上,敲除了衣康酰辅酶A转移酶Ict A。经q RT-PCR分析,敲除ict A菌株S2288中的ict A基因不再发生转录。与黑曲霉S2209菌株相比,重组菌S2288经摇瓶发酵,衣康酸的滴度提高至8.70 g/L。（5）为了强化衣康酸前体顺乌头酸的供给,从而提高衣康酸的滴度。在黑曲霉S2288菌株中,过量表达乌头酸酶Aco A,得到了重组菌S2444;经摇瓶发酵6d,衣康酸的滴度达到了9.08 g/L。
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