核黄素是黄素辅基的组成成分,参与机体复杂的氧化过程,具有重要的药理学作用,除治疗传统的核黄素缺乏病外,新近的药理学研究表明核黄素及其衍生物还具有辅助治疗冠心病、高血压、关节炎、烧伤等方面的作用。但核黄素是水溶性维生素,易从汗液及尿中排除体外,半衰期短,生物利用度低,难以发挥药物治疗效果,极易引起各种核黄素缺乏症。我院于本世纪60年代研制了长效核黄素油混悬注射液制剂,一次肌肉注射150mg,长效三个月,并曾于70年代和90年代先后两次装备部队,为防治常见的核黄素缺乏病提供了一种重要的药物疗法。近些年来的应用还发现长效核黄素制剂在白血病骨髓移植和抗肿瘤化疗、放疗的辅助治疗中获得了满意的效果,增强了病人的耐受性,提高了治疗效果,显示了广阔的应用前景。但该药由于没有临床批文,目前只在部队医院内部使用,限制了进一步的推广。以往的研究发现长效核黄素为一多组分混合物,其主要有效成分9010-Ⅰ属我们首次合成的一种核黄素衍生物,其溶解度低,不能在水溶液中稳定存在,分离纯化十分困难,过去沿用的TLC及HPLC方法只能纯化极少量的样品,很难实现工业化放大,纯化获取大量长效核黄素单组分(9010-Ⅰ)就成为制约新药开发的关键技术瓶颈。 本研究目的在于重点解决长效核黄素单组分(9010-Ⅰ)分离纯化的关键技术瓶颈问题,建立能大量制备长效核黄素单组分的纯化工艺,按一类新药要求制备1kg以上样品,为完成新药临床前研究提供原料药,同时利用酶促催化的高选择性,探索长效核黄素9010-Ⅰ的定向合成,为寻找一种高选择的合成途径打下基础,主要研究内容与结果如下: 1.通过对不同载体及洗脱溶剂的选择,最终建立了以LH-20为载体,DMF为洗脱溶剂的柱层析方法,一次柱层析样品纯度达标90.59%,所得样品用乙酸乙酯两次重结晶,样品纯度经HPLC分析可达99.85%,最终收率按原料计算为23.70%。该制备工艺具有重现性好,凝胶柱对样品基本无吸附,回收率高,洗脱溶剂可回收反复利用等特点,该工艺还可以根据生产要求进行平行放大,可满足大规模制各的要求。目前,已用此工艺制备了1Kg以上的纯品,该化合物经四大光谱及二维超导核磁共振分析鉴定其结构式为核黄素-5’-月桂酸酯。 2.从一株芽孢杆菌中克隆209蛋白酶的基因,该酶的基因与枯草芽孢杆菌蛋白酶BPN’基因密码有89.01%相似性,而翻译的氨基酸有97.38%的相似。在该酶的42个与枯草杆菌蛋白酶BPN’基因不同的密码中,有32个密码为同义密码。在克隆209蛋白酶基因的基础上,我们通过构建不同缺失片段的重组子,筛选到了一株缺失信号肽序列的基因片段,以pET3a为载体在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达,表达量为47.27%,所得的酶具有很高的催化活性,比活性为28U/mg。该酶在pH=10显示最高的催化活性,稳定性高,最适催化温度为60℃。以DEAE纤维素为载体固定化表达的酶,用月桂酸乙酯为酰化剂,DMF作为助溶剂,对核黄素实现了定向酰化,薄层层析、HPLC及FAB质谱分析均证明反应产物为目标化合物9010-Ⅰ。