支气管哮喘(以下简称哮喘)是最常见的以气道高反应性(AHR)为特征的慢性呼吸道疾病。现代医学在治疗时,多数采用糖皮质激素在内的抗炎药物治疗为目前比较流行的治疗手段,但从流行病学分析,并未发现哮喘患病率和死亡率降低,这提示现代医学尚未能提出根治哮喘方案,而且众所周知的长期应用糖皮质激素的副作用,使其在广泛应用上受限。我国传统医学在长期的医疗实践中积累了丰富的经验,当前的治疗方法很多来源于中医药。小青龙汤为始载于东汉著名医家张仲景所著《伤寒论》的经典名方,临床应用广泛,《中国药典临床用药须知(中药卷)》记载其制剂临床主要用于喘证,大量临床报道表明小青龙汤及制剂治疗支气管哮喘效果卓著。但是,如何才能够保证其临床用药的合理、安全、有效,这一切都必须建立在对其药效机理研究及其有效成分药代动力学研究的基础之上。本课题以经典名方小青龙汤的现代制剂小青龙颗粒为研究对象,分析比较了SD大鼠给服中药复方小青龙颗粒和单味麻黄药材后麻黄碱、伪麻黄碱在其体内的药代动力学过程差异,阐明中药复方配伍对于中药有效成分体内过程的影响;并研究哮喘SD大鼠灌服不同时间小青龙颗粒后,哮喘症状的改善情况,分析小青龙颗粒对于哮喘SD大鼠治疗过程的影响。1文献综述查阅整理了近10年来国内外小青龙汤治疗哮喘研究,麻黄碱、伪麻黄碱药代动力学研究和中药药代动力学研究的相关文献资料,对小青龙汤及方中各药哮喘治疗作用的研究概况进行了系统的总结和综述;就麻黄碱、伪麻黄碱药代动力学研究进展进行了综述;就中药药代动力学的进展进行了综述,掌握了相关领域科研前沿动态,并总结出了目前中药药代动力学研究的不足及努力方向。2实验研究2.1药代动力学研究2.1.1 SD大鼠给服小青龙颗粒后麻黄碱、伪麻黄碱在血浆中的药代动力学研究建立了用于同时测定麻黄碱(ephedrine,E)、伪麻黄碱(pseudoephedrine,PE)血浆中浓度的HPLC法,并探讨了SD大鼠灌服小青龙颗粒后二者在体内的药代动力学特征。以盐酸苯丙醇胺为内标物,血浆以乙醚萃取,并用硫酸萃取乙醚层处理后,用HPLC内标法测定给药后不同时间点大鼠的血药浓度,将所得数据用3P97药代动力学程序处理,求出相关药代动力学参数:E、PE分别在0.008-0.985μg/mL和0.004-0.492μg/mL的范围内线性关系良好(r=0.9997、r=0.9997),检测限分别为0.002、0.001μg/mL,平均回收率分别为100.5%和101.53%。两者平均日内、日间精密度分别为3.20%、5.44%和5.05%、4.47%,血浆样品在60天内稳定,符合生物样本分析要求;大鼠在灌服小青龙颗粒后,麻黄碱血药浓度-时间曲线呈一室模型,半衰期1.41h、清除速率0.49/h、表观分布容积9.19(μg)/(μg/mL);伪麻黄碱血药浓度-时间曲线呈一室模型,半衰期1.27 h、清除速率0.54/h、表观分布容积7.91(μg)/(μg/mL)。2.1.2 SD大鼠给服麻黄提取物后麻黄碱、伪麻黄碱在血浆中的药代动力学研究SD大鼠灌服麻黄提取物后,用HPLC法测定不同时间点大鼠血浆中麻黄碱、伪麻黄碱浓度,将所得数据用3P97药代动力学程序处理,求出相关药代动力学参数:大鼠在灌服麻黄药材提取物后,麻黄碱血药浓度-时间曲线呈一室模型,半衰期0.65h、清除速率1.07/h、表观分布容积8.75(μg)/(μg/mL);伪麻黄碱血药浓度-时间曲线呈一室模型,半衰期1.11 h、清除速率0.62/h、表观分布容积11.48(μg)/(μg/mL)。2.1.3麻黄碱、伪麻黄碱在复方及单味药中药动学过程差异分析本研究中,复方状态使得麻黄碱、伪麻黄碱的体内过程发生了以下的变化:麻黄碱:配伍提高了AUC,表明复方配伍增加了麻黄碱被生物体吸收的程度;降低了CL,即减缓了机体对麻黄碱清除的速率,延长其在体内的停留时间,保证体内有足够的药量发挥作用;延长了t1/2ke,表明配伍延长了麻黄碱在血内的存留时间。伪麻黄碱:配伍提高了AUC,表明复方配伍增加了伪麻黄碱被生物体吸收的程度;降低了CL,即减缓了机体对伪麻黄碱清除的速率,延长其在体内的停留时间,保证体内有足够的药量发挥作用;降低Vd,表明配伍使得伪麻黄碱主要分布于血液中。上述在一定程度上用药动学参数体现了了中药复方配伍的意义。2.2药效学研究2.2.1小青龙颗粒对哮喘大鼠肺功能的影响实验中用卵清蛋白注射致敏动物,造成发作期哮喘模型,建模完成后,实验组设置两个给服小青龙颗粒时间组(5日组、10日组),并设阳性对照组喂饲地塞米松(5日),空白组给予生理盐水,再以卵蛋白作为抗原攻击激发气道高反应性,测定大鼠肺功能的变化。肺功能测定结果显示,正常对照组测定吸气阻力(Ri)、呼气阻力(Re)、计算第0.2秒用力呼出容积占用力肺活量百分比(Fev0.2/ FVC)分别为2.39、2.09和77.52。与正常对照组相比,哮喘模型组的Ri、Re均升高,Fev0.2/ FVC明显降低,分别为3.03(P<0.05)、2.57(P<0.05)和59.50(P<0.01),哮喘大鼠服用地塞米松和中药后,阳性药地塞米松组与中药组均可明显升高Fev0.2/FVC比值(阳性药组:P<0.01;XQL5:P<0.05;XQL10:P<0.01),Ri、Re值有降低的趋势,其中阳性药组和XQL10组的Ri值与模型组相比有差异(P<0.05)。2.2.2小青龙颗粒对哮喘大鼠血清中T-IgE含量的影响建立大鼠哮喘模型,以抗原末次激发后,取血清,用放射免疫法测定大鼠血清中总IgE,结果显示正常对照组血清IgE水平为0.0149 UI/ml,哮喘模型组血清总IgE水平与正常对照组相比显著升高,可达到0.0387 UI/ml(P<0.01)。给药地塞米松后可将IgE水平降低至0.0177 UI/ml,恢复到正常水平,用中药进行治疗,10日给药组的IgE呈现下降趋势,可降至0.0250 UI/ml,并有显著性差异(P<0.05),而5日给药组与模型组相比总IgE并没有降低的趋势。中药10日给药组可以通过降低血清总IgE水平,抑制I型超敏反应,而中药5日给药组并不能显著降低血清中总IgE水平。2.2.3小青龙颗粒对哮喘大鼠肺泡灌洗液(BALF)中IL-4含量的影响建立大鼠哮喘模型,以抗原末次激发引喘后,以放射免疫法测定BALF中IL-4水平。结果显示,空白组、阳性药组(地塞米松给药5日)、小青龙颗粒10日给药组BALF中IL-4含量分别为0.5234、0.5494、0.5526 ng/ml,与模型组(1.0200 ng/ml)相比有显著性差异(P<0.05),小青龙颗粒5日给药组BALF中IL-4含量(0.8822 ng/ml)与模型组比较无显著性差异,但是有减少的趋势。即哮喘SD大鼠经过阳性药地塞米松(5日给药)和小青龙颗粒(10日给药)后能够明显减少BALF中IL-4的含量,而小青龙颗粒给药5日治疗组对哮喘大鼠BALF中IL-4含量的影响并不明显。3研究结论本课题研究了中药有效成分麻黄碱、伪麻黄碱在复方(小青龙颗粒)、单味药(麻黄药材)状态下在SD大鼠体内的药动学差异。结果显示,配伍配伍增加了麻黄碱、伪麻黄碱被生物体吸收的程度;减缓了机体对麻黄碱、伪麻黄碱清除的速率,延长其在体内的停留时间,保证体内有足够的药量发挥作用。上述在一定程度上用药动学参数体现了了中药复方配伍的意义。本课题研究了哮喘SD大鼠给服小青龙颗粒5日、10日和给服地塞米松5日后,肺功能、血清中T-IgE、BALF中IL-4的变化。结果显示,给小青龙颗粒10天和地塞米松5天后,哮喘SD大鼠的各指标均有明显改善;给小青龙颗粒5日后,哮喘SD大鼠的各指标有改善趋势,且是大多没有表现出差异。中药与西药治疗效果上的差异,可能是因为作用机制不同,也可能是在作用机制相同的情况下,中药效果较差。目前支气管哮喘治疗的主流方法糖皮质激素疗法仅是一种针对支气管局部炎症进行抗炎的治疗方法,并不能调整患者全身紊乱的免疫状态,且存在着很多的副作用,限制了它的使用。而中医、中药治疗哮喘过程中渗透了标本兼治的思想,通过辩证论治,整体调节机体的各种系统治疗哮喘,不失为哮喘防治发展方向上的一个重要突破口。因此,我们有必要加深对中医药治疗哮喘的研究,以其药动、药效特征为指标,通过剂型改革、优化处方、改变配伍、改变给药方式等途径,探索疗效确切而且毒副作用小的治疗方法,将会降低患者的痛苦,提高患者生存质量。上述研究,采用高效液相法、放射性免疫法等多种方法和技术,对小青龙颗粒的体内药代动力学、治疗发作期哮喘药效和机理研究进行了多项探索,为探讨中医药对支气管哮喘的预防和治疗作用提供了科学依据,并为进一步开展中药复方药代动力学(PK-PD)结合研究奠定基础。