补骨脂素激活MAPK-NF-κB信号通路促进成骨细胞增殖的研究

来源 :广州中医药大学 | 被引量 : 21次 | 上传用户:lvjjvl
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目的:骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病,可以导致骨的脆性增加和发生骨折。约50%的女性由于绝经后雌激素缺乏可能会引起骨质疏松症。为了减少绝经后女性骨质疏松引起的骨折,药物治疗在于增加骨形成或减少骨吸收。目前的药物在减少骨折发生的同时也有一定的副作用,研究者力图寻找没有不良反应的具有选择性雌激素受体调节剂(SERMs)优点的自然替代物。最近的研究表明,植物雌激素是治疗骨质疏松症理想的天然选择性雌激素受体调节剂。补骨脂素是中草药补骨脂的主要活性成分,作为一种植物雌激素用于治疗骨质疏松症。一些研究已证实补骨脂素在成骨中的作用,然而,补骨脂素诱导成骨细胞成骨的通路和潜在的分子机制尚不明确。我们在体外用补骨脂素处理hFOB1.19(成骨细胞),明确补骨脂素对成骨细胞的作用和涉及的信号通路。方法:(1)补骨脂素对hFOB1.19细胞的作用:hFOB1.19细胞培养基加入一系列不同浓度的补骨脂素,培养24 h后,收集细胞。CCK8检测细胞活力,qPCR和Western blotting检测GLUT3的表达水平,确定补骨脂素处理hFOB1.19细胞的浓度和时间。(2)补骨脂素对MAPK信号通路研究:实验分为五组:正常组、补骨脂素组(hFOB1.19细胞培养基中加入补骨脂素)、p38信号通路抑制剂SB203580组(hFOB1.19细胞培养基中加入补骨脂素和p38信号通路抑制剂SB203580)、ERK信号通路抑制剂SCH772984组(hFOB1.19细胞培养基中加入补骨脂素和ERK信号通路抑制剂SCH772984)和JNK信号通路抑制剂SP600125组(hFOB1.19细胞培养基中加入补骨脂素和JNK信号通路抑制剂SP600125)。培养48h后收集细胞,CCK8检测细胞的增值能力,提取总蛋白,Western blotting检测各组p38、ERK1/2、 JNK蛋白磷酸化水平以及p65、 GLUT3的表达水平。(3)补骨脂素对NF-kB信号通路的研究:实验分为三组:正常组、补骨脂素组(hFOB1.19细胞培养基中加入补骨脂素)、NF-kB信号通路抑制组(hFOB1.19细胞培养基中加入补骨脂素和NF-kB信号通路抑制)。培养48h后收集细胞,CCK8检测细胞的增值能力,提取总蛋白,Western blotting检测p65、 GLUT3的表达水平。结果:(1)补骨脂素对hFOBl.19细胞有增殖作用:CCK-8检测表明,hFOBl.19细胞在15μ M补骨脂素下存在明显的依赖作用,qPCR及Western blotting检测15μM浓度下补骨脂素对hFOBl.19细胞的GLUT3的表达最明显,与CCK-8检测结果一致。补骨脂素对hFOBl.19细胞增殖最佳时间点,本研究通过CCK-8检测表明,48h内15μM浓度下补骨脂素对hFOBl.19细胞有明显增殖作用,72h后细胞数量开始减少,qPCR和Western blotting检测48h时补骨脂素对hFOB1.19细胞的GLUT3的表达最明显,与CCK-8检测结果一致(P<0.05)。(2)补骨脂素可激活MAPK信号通路:hOB1.19细胞培养基中加入15 uM补骨脂素作用下,再分别进行SCH772984、 SB203580、SP600125处理后提取ERK、 P38、JNK以及GLUT3的蛋白。Western blotting检测表明,ERK、P38、JNK蛋白水平在三个组别里面没有明显的差异性;与单独加补骨脂组相比较,在加入抑制剂后,ERK、 P38、 JNK蛋白的磷酸化水平以及p65和GLUT3蛋白水平显著降低。CCK-8检测表明,MAPK抑制剂可显著抑制补骨脂素诱导成骨细胞增殖(P<0.05)。(3)补骨脂素可激活NF-kB信号通路:hOB1.19细胞培养基加入15μM补骨脂素作用下,NF-kB抑制剂(PDTC)处理后提取p65和GLUT3的蛋白。Western blotting检测表明,与单独加补骨脂组相比较,加入NF-kB抑制剂(PDTC)组的p65和GLUT3蛋白水平显著降低。CCK-8检测表明,NF-kB抑制剂(PDTC)可以下调补骨脂素对hOB1.19细胞的增殖作用(P<0.05)。结论:补骨脂素可激活MAPK-NF-kB信号通路促进成骨细胞增殖,是选择性雌激素受体调节剂(SERMs)理想药物,应用于骨质疏松治疗具有广阔的前景。
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