可再生清洁能源的开发和利用技术日益受到重视,其中车用清洁能源燃料乙醇是现实可行的方案。以来源广泛且价格低廉的木质纤维素为原料生产燃料乙醇,避免了与人争粮的弊端,具有更广阔的前景。酿酒酵母是传统的乙醇生产菌株,能够高效发酵,利用多种糖进行乙醇生产,尤其偏好葡萄糖。木糖是木质纤维素中含量仅次于葡萄糖的第二丰富的糖,木糖的高效利用是降低木质纤维素为原料生产乙醇成本的关键环节之一。在重组酿酒酵母中,木糖经过木糖还原酶、木糖醇脱氢酶依次催化形成木酮糖或直接经过木糖异构酶一步生成木酮糖;木酮糖经过木酮糖激酶的磷酸化生成木酮糖-5-磷酸,然后进入磷酸戊糖途径,并以果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸两种中间代谢物形式进入糖酵解途径。但是经过代谢工程和进化工程获得的重组酿酒酵母对木糖利用的能力仍然不足。首先,木糖为唯一碳源时,其代谢速率仅为葡萄糖的二分之一;其次,在发酵同时含有葡萄糖木糖为原料时,葡萄糖首先被快速利用,之后细胞生长代谢速率显著下降。相对于对葡萄糖代谢的深入研究,木糖代谢机制的研究仍然不足。但是据木糖代谢的经由途径可推测,保持葡萄糖信号系统的激活状态,从而保持高水平的糖酵解和磷酸戊糖途径对木糖代谢效率十分重要。基于此,我们以实验室前期构建的可利用木糖的重组酿酒酵母为对象,进行了以下研究。(1)酿酒酵母葡萄糖代谢由几个信号系统和代谢途径相互作用协调的。AMPK/Snf1p是酿酒酵母的葡萄糖效应的一个重要转录调节系统,其中Hxk2p-Mig1p是下游调节途径的重要组分。在葡萄糖诱导状态下,Hxk2p的Ser14位点为非磷酸化状态,能与Mig1p相互作用形成阻遏物复合体;而当葡萄糖匮乏或以非发酵性碳源为底物生长时,Hxk2p被Snf1p磷酸化,从细胞核转运到细胞质中,不再结合Hxk2p的Mig1p也会重新定位到细胞质,失去调节作用。本论文的第一项工作研究内容是研究调节该途径对木糖代谢的影响,开发相应的促进木糖代谢的调节元件,同时在理论上细化Snf1p-Hxk2p/Mig1p系统的调节细节。我们首先敲除了 SNF1,理论上,该操作可以直接阻止Hxk2p的磷酸化,从而使该途径保持葡萄糖存在时的状态,但结果显示,敲除SNF1不利于木糖代谢,这可能是因为Snf1p影响面过于广泛,对细胞生长代谢产生了负面影响。继而,我们研究了酿酒酵母Hxk2p细胞亚定位对木糖代谢的影响,我们分别用HXK2S14A和HXK2S14D替换了能利用木糖的酿酒酵母工程菌株中的HXK2。Hxk2ps14A突变体维持非磷酸化状态,因而进入细胞核内并发挥转录调控作用;而Hxk2ps14D突变体则会滞留在细胞质中,不进入细胞核发挥转录调节作用。重组菌株发酵结果显示,表达Hxk2pS14A突变体有利于提高酿酒酵母利用木糖生产乙醇的能力,与野生型相比,好氧状态下表达Hxk2pS14A突变体的菌株木糖比利用速率比对照菌提高了 25.6%(p-value≤0.05),乙醇产生阶段的乙醇比生产速率提高了 59.0%(p-value≤0.05)。限氧条件下,表达Hxk2pS14A突变体的酿酒酵母菌株利用木糖生产乙醇的能力比野生型提高了12.2%(p-value≤0.05)。Hxk2pS14D突变体对菌株的木糖代谢则没有明显的影响。结果表明,HXK2S14A是比缺失SNF1更好的促进木糖代谢的调节元件,并且,调节作用在有氧条件更为明显。之后,我们进一步研究了HXK2S14A突变体对木糖代谢的优化是否依赖Mig1p蛋白,研究证明,缺失MIG1会消除HXK2S14A对木糖代谢的促进作用,推测HXK2S14A突变体对木糖代谢的优化作用需要Mig1p蛋白的存在。但是,我们对遗传型为HXK2S14A的菌株与野生型菌株进行了代谢特征和转录组差异对比分析,发现除了与Mig1p相关的AI1、AI2、COX2及COX3等使呼吸代谢发生一定程度的下调外,差异基因的30%都与核糖体的合成相关,其中核糖体合成的关键调节基因TOD6发生明显上调,说明核糖体的合成处于相对解抑制的状态,HXK2对Ras蛋白的定位起关键作用,而且核糖体合成主要受Ras-cAMP的调节,因此HXK2S14A的菌株对代谢的调整除了与Mig1p蛋白的共同作用外,可能还参与了 Ras-cAMP途径的调节。(2)木糖代谢时先进入磷酸戊糖途径,之后通过果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸两种化合物进入糖酵解途径,和葡萄糖代谢最明显的区别即为绕过了重要效应物葡萄糖-6-磷酸。烯醇化酶催化从甘油酸-3-磷酸形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸的反应,是糖酵解中的关键酶之一,转录组研究显示,木糖发酵时ENO2转录水平仅为葡萄糖发酵时的59.5%,而葡萄糖-6-磷酸是ENO2的重要诱导物。经测试发现,两种糖分别为碳源情况下细胞内的葡萄糖-6-磷酸浓度相当,但木糖为碳源时烯醇化酶总酶活仅达到葡萄糖为碳源时的29%。继而,我们在木糖利用重组酵母基础上构建了缺失ENO2、超表达ENO2、以及超表达Eno2p同工酶基因ENO1的重组菌株,并研究了这些扰动对菌株生长代谢的影响。结果显示,缺失ENO2或超表达ENO1对菌株没有明显影响,但超表达ENO2降低了菌株的生长,72小时内木糖利用量比野生型降低了 28.8%,并严重抑制了乙醇的产生。推测在糖酵解中,两种烯醇化酶的比例及表达量对木糖利用而言是较为合适的,没有影响木糖的利用效率。(3)酵母根据碳源种类在发酵和氧化代谢之间转换。碳源分解反应的中间代谢产物丙酮酸是糖代谢的关键分支点。呼吸代谢时,进入线粒体的丙酮酸通过呼吸作用彻底分解为水和CO2;酵解代谢时,上游分解反应产生大量丙酮酸,而呼吸途径被发酵性碳源阻遏,大量丙酮酸未能进入线粒体而在细胞质内转化为乙醇。有研究显示,木糖培养条件下,酿酒酵母细胞处于一种介于呼吸代谢和酵解代谢之间的状态。在酿酒酵母中,MPC1/2/3三个基因编码的丙酮酸转运载体蛋白负责不同代谢条件下的丙酮酸运输。呼吸代谢中,由Mpc1/3p组成的高效MPCox转运载体负责;发酵状态下,由Mpc1/2p组成的转运能力远低于MPCox的MPCFERM负责。研究结果表明,单独敲除MPC3对代谢没有造成很大的扰动,乙醇积累也不明显。敲除丙酮酸转运载体必须组分基因MPC1的重组菌株,在2%木糖好氧发酵中,重组菌株的比生长速率不受影响,菌体得率比野生型低17.2%(0.29/0.24,p-value≤0.05),乙醇积累明显,最高产量达到1.26 g/L,比野生型增加12.45%(p-value≤0.05),说明完全破坏丙酮酸转运载体不影响木糖代谢速率,但能够提高木糖发酵中乙醇的产量。综上,扰动己糖激酶Ⅱ(Hxk2p)的定位从而改变其功能状态,能够部分维持葡萄糖效应系统中有利于木糖代谢的信号通路激活,HXK2S14A突变体维持核内的调节功能有效的优化了木糖代谢。另一方面,MPC1缺失后导致丙酮酸转运载体的完全功能破坏,提高丙酮酸在细胞质中的浓度,也有效的增加了乙醇的积累。因此从调整细胞的代谢状态分析,找出对木糖代谢有促进意义的机制与元件,不仅能进一步促进酿酒酵母的木糖代谢,也对提高其他底物利用具有重要的参考意义。