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目的:制作大鼠四动脉结扎(four-vessel occlusion, 4-VO)全脑缺血(global cerebral ischemia, GCI)模型,研究延迟性脑缺血后处理(delayed ischemic postconditioning, PostC)介导的Akt/GSK3β信号通路对大鼠缺血性神经元损伤的保护作用及抗线粒体凋亡机制。方法:1. SPF级成年雄性SD大鼠,体重250～300 g,制作四动脉结扎全脑缺血模型,缺血8 min。实验动物随机分为:假手术组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、延迟性脑缺血后处理组(PostC组)、溶剂对照组(PostC + Vehicle组)、抑制剂组(PostC + LY294002组)。假手术组仅暴露双侧颈总动脉,但不进行缺血;缺血再灌注组暴露双侧颈总动脉并夹闭8 min;延迟性脑缺血后处理组于缺血8 min后,再灌注48 h后行二次缺血3 min,溶剂对照组及抑制剂组分别在二次缺血前20 min脑室注射DMSO及LY294002。实验分组和流程如Fig. 1所示。2.激光扫描共聚焦显微镜技术观察大鼠海马CA1区神经元存活情况。3.脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)在激光扫描共聚焦显微镜下观察大鼠海马CA1区神经元的凋亡情况。4.透射电镜技术观察大鼠海马CA1区神经元的超微结构。5.免疫胶体金染色技术透射电镜下观察大鼠海马CA1区神经元内细胞色素C(Cyt c)的分布情况。6.激光扫描共聚焦显微镜技术及Western blot法观察大鼠海马CA1区神经元内及其线粒体内Akt、GSK3β激酶的磷酸化水平,及Cyt c、Bax等蛋白的亚细胞分布。7.利用JC-1染色法检测大鼠海马CA1区神经元线粒体膜电位的变化。结果:1.延迟性脑缺血后处理具有抗缺血性神经元损伤作用,该保护作用能够被Akt上游激酶抑制剂LY294002部分抑制(如Fig. 2所示)。激光扫描共聚焦显微镜结果显示,与I/R组相比,PostC组大鼠海马CA1区及皮质区存活神经元数量明显增加,凋亡神经元数量明显减少;PostC+LY294002组大鼠海马CA1区及皮质区存活神经元数量明显低于PostC组,而凋亡神经元的数量明显高于PostC组,大致同I/R组。延迟性脑缺血后处理抑制全脑缺血大鼠海马CA1区及皮质区神经元的凋亡,促进神经元的生存,且该神经元保护作用能够被LY294002抑制。2.延迟性脑缺血后处理抑制全脑缺血大鼠海马CA1神经元线粒体损伤,LY294002能够部分抑制后处理的保护作用;PostC能够抑制缺血再灌注引起的血脑屏障损伤及神经元的脱髓鞘样改变。结果显示(Fig. 3A),sham组神经元的核膜清晰,线粒体结构完整,双层膜结构清晰可见,嵴排列紧密;I/R组神经元核膜模糊,线粒体结构破坏严重,水肿,内室高度扩张,呈空泡,状嵴断裂,外膜呈多边形样改变;PostC组神经元核膜清楚,线粒体损伤轻微,水肿及嵴断裂不明显;PostC+Vehicle组同PostC组,结果中未显示;PostC+LY294002组大致同I/R组。此外(Fig. 3B所示),I/R组血管缝隙连接损伤明显,连接处电子密度不均匀,PostC组缝隙连接规则紧密,电子致密度均一,损伤不明显。再次(Fig. 3C所示),I/R组髓鞘改变明显,疏松状,且髓鞘内线粒体高度空泡变性;而PostC组髓鞘结构完好,其内线粒体结构正常。3.延迟性脑缺血后处理诱导线粒体内促生存激酶Akt及GSK3β磷酸化水平升高(Fig. 4)。Western Blot结果显示,PostC组再灌注30 min、6 h、1 d时间点大鼠海马CA1区神经元线粒体内p-Akt及p-GSK3β水平明显升高。激光扫描共聚焦显微镜观察结果同Western Blot结果。4.延迟性的脑缺血后处理能够抑制全脑缺血大鼠海马CA1区神经元线粒体膜电位的下降,LY294002能够抑制此改变(Fig. 5)。表现sham组红色荧光明显,而绿色荧光几乎看不到,神经元存活良好;I/R组绿色荧光强,大部分神经元线粒体膜电位降低,即神经元处于凋亡状态;PostC组红色荧光较强,线粒体膜电位处于较高水平,神经元生存;PostC + LY294002组大致同I/R组。5.延迟性脑缺血后处理抑制全脑缺血大鼠海马CA1区神经元线粒体内Cyt c释放到胞浆。Western Blot结果(Fig. 6A)显示,与I/R组相比,PostC组胞浆内Cyt c水平在再灌注30 min、6 h、1 d均显著降低;而总蛋白内I/R组与PostC组水平在个时间点变化不明显。其次(Fig. 6B),免疫胶体金电镜结果显示,I/R组线粒体损伤明显,基质水肿,嵴断裂崩解,呈高度空泡状,金颗粒弥漫分布,胞浆内分布较多;而PostC组线粒体结构完好,嵴排列紧密整齐,双层膜结构少见,金颗粒集中分布在线粒体,胞浆内胶体金颗粒分布较少。免疫荧光染色结果(Fig. 6C)示PostC组与I/R组相比Cyt c与COXⅣ(线粒体内参)共定位明显,进一步说明PostC能够抑制Cyt c从线粒体释放到胞浆。6.延迟性脑缺血后处理抑制全脑缺血大鼠海马CA1区神经元胞浆内Bax转位到线粒体(Fig. 7)。表现为与I/R组相比,PostC组胞浆内Bax表达水平在再灌注30 min、6 h、1 d时间点均显著升高,而在相同时间点线粒体内Bax表达情况恰好与胞浆内呈相反变化趋势,而总蛋白内Bax的表达在各组各个时间点的变化则不明显。7. Akt上游激酶(PI3K)抑制剂LY294002抑制延迟性脑缺血后处理诱导的线粒体内p-Akt,p-GSK3β水平升高;并对抗延迟性脑缺血后处理对神经元线粒体内Cyt c释放及胞浆内Bax转位的抑制作用(Fig. 8)。结论:延迟性脑缺血后处理通过激活线粒体内Akt/GSK3β信号转导通路,抑制全脑缺血大鼠海马CA1区神经元线粒体膜电位的下降,进而阻止线粒体膜通透性转换孔的开放,抵御缺血再灌注引起的线粒体内Cyt c释放到胞浆及胞浆内Bax转位到线粒体,最终达到抗缺血性神经元凋亡的作用。