手性光学传感阵列的构建及应用研究

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生命体是一个天然的手性体系,构成生命体的氨基酸、多糖、蛋白质和核酸等生物分子都具有手性,它们的手性影响着细胞或机体的行为与功能,因此开发用于生物分子手性研究的新方法具有十分重要的意义。然而,生物基质带来的背景干扰与手性生物分子之间微妙的结构差异使得传统的手性检测手段如旋光仪法、圆二色光谱(CD)法等难以实现复杂生物基质中生物分子的手性检测。近年来,基于交互响应的传感阵列已经被证明了在复杂基质中区分结构、性质相似的分析物的优越性,因此传感阵列应用于复杂基质中生物分子的手性检测具有极大的潜力。在传感阵列的研究中,光学信号具有灵敏度高、分析快速和成本低等优点,因而被广泛的应用于传感阵列的设计中。本论文设计了三种新型的基于光学信号的手性传感阵列,并将其应用于复杂体系中手性生物分子的检测和药物筛选研究。本论文的具体内容和主要实验结果如下:(1)首先,利用主客体化学和MoS2纳米片的特性,我们设计了一种新型的手性光学传感阵列并将其应用于手性氨基酸的识别。采用荧光指示剂置换法,39种氨基酸(甘氨酸、19种组成蛋白质的L-氨基酸及其对应的19种D-氨基酸)得到了有效的鉴别,训练集和未知样品的判别正确率分别为98.7%和93.6%。我们将该传感阵列应用于氨基酸(异亮氨酸)对映体纯度的识别,实验结果表明,训练集样品得到了完全的区分,未知样品的判别正确率为95.8%。在氨基酸浓度检测实验中,L-色氨酸在20 nM-500μM范围内传感得到的典型函数因子1(F1)与浓度的对数呈现良好的线性关系。此外,复杂基质中氨基酸的浓度也能得到有效的判别。在0-8μM浓度范围内,复杂基质中的D-苯丙氨酸通过传感得到的F1与浓度呈现良好的线性关系,说明了该传感阵列在真实复杂样品中应用的潜力。(2)我们将上述基于MoS2纳米片的传感阵列应用于细菌肽聚糖生物合成的监测。利用细菌之间肽聚糖的氨基酸种类、手性和含量的差异,五种细菌得到了有效的鉴别,训练集和未知样品的判别正确率都为100%。细菌在不同生长阶段和不同外源性D-氨基酸刺激下肽聚糖氨基酸组成的微小变化也能得到有效的监测,通过线性判别分析(LDA)可知,肽聚糖氨基酸组成的变化遵循一定的规律,这种规律可以用判别分析典型得分图进行描述。当利用传感阵列对不同生长时间的金黄色葡萄球菌肽聚糖进行传感时,F1随着细菌培养时间的增加而逐渐增大,在得分图中表现为得分点逐渐接近得分图右侧边界。而对外源性D-氨基酸(D-蛋氨酸、D-缬氨酸和D-苯丙氨酸)刺激下大肠杆菌肽聚糖生物合成的监测结果显示,外源性D-氨基酸被细菌利用从而合成到细菌肽聚糖短肽中。该传感阵列具有快速、高通量的特点,在混合物的分析中具有极大的优越性,因此在真实复杂生物样品分析中具有很好的应用前景。(3)其次,结合具有等离激元特性的金岛膜和对蛋白质二级结构具有不同选择性的配体,我们设计了一种手性等离激元传感阵列用于蛋白质的综合分析。通过CD信号的传导,23种蛋白质得到了有效的识别,训练集和未知样品的判别正确率分别为98.6%和92.8%。聚类分析的结果显示,该传感阵列对蛋白质的识别主要依赖于蛋白质的二级结构组成。随后,我们初步探索了该传感阵列在复杂混合蛋白质中的应用。对于二级结构组成相同的混合蛋白质,传感阵列显示出优异的区分能力。此外,该传感阵列还能应用于蛋白质构象疾病阿尔兹海默症(AD)疾病标志物Aβ42的纤维化过程监测。通过LDA的分析可知,Aβ42的纤维化过程在典型得分图中遵循一定的轨迹,根据该轨迹可以实现AD病疾病进程的判断。当Aβ42聚集体的浓度范围为10 nM-5μM时,通过阵列传感得到的F1与浓度的对数呈现良好的线性关系;而利用受体对低丰度蛋白质的选择性富集作用,传感阵列对Aβ42的检测可以达到pM级别。此外,该传感阵列还具备重复利用性和抗干扰性,因此在复杂混合蛋白质的研究中具有较大的潜力。(4)我们将上述基于金岛膜的传感阵列应用于蛋白质组学的研究。在进行混合蛋白质的(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)分析时,被受体吸附的蛋白质可以实现直接地质谱分析而无需洗脱;经过受体的选择性吸附,低丰度蛋白的检测灵敏度大大的提高。通过质谱成像,可以实现AD病疾病进程的诊断。对两种肝癌细胞HepG2和Hep3B分泌蛋白质组的比较研究发现,受体对低丰度蛋白质具有良好的富集作用,通过受体的富集,大量低丰度蛋白得到了鉴定,大大的拓宽了蛋白质组的研究范围。分析蛋白质组的二级结构组成可以发现,蛋白质富集的机制主要依赖于蛋白质的二级结构组成。而对蛋白质的生物功能进行分析可以发现,经过受体的选择性富集,蛋白质组的分子功能发生了明显的改变。通过比较分泌蛋白经过受体吸附前后与癌症发展的相关性可知,经过受体富集后,分泌蛋白质组中与癌症发展相关的蛋白质比例明显增加,HepG2和Hep3B分泌蛋白质组中与癌症相关的蛋白质比例差异增大,说明该传感阵列更有利于区分癌细胞、发现与癌症发展相关的生物标志物。该传感阵列既能通过CD信号对复杂混合蛋白质进行分析,又能对复杂蛋白质组中低丰度蛋白质进行富集,还能与质谱仪联用,因此在蛋白质组学的研究中具有较大的应用前景。(5)最后,利用G-四链体DNA的手性,我们设计了一种等离激元传感阵列用于G-四链体配体的筛选及其作用机制研究。采用8个作用模式已知的配体建立训练集,并用5个未知配体进行有效性验证,结果显示,该训练集对配体作用模式的判别正确率为100%。与荧光法相比,该传感阵列能降低背景信号带来的干扰,提高判别的准确性。此外,我们初步探索了该传感阵列应用于复杂混合物中配体的筛选,结果表明,该传感阵列对复杂混合物中低浓度配体具有选择性捕获的能力,且被捕获的配体可以进行洗脱和质谱鉴定,因此该研究工作为药物筛选提供了新的思路。本文构建的三种传感阵列是新颖而有效的,其设计和传感机制均未见报道。而利用这三种传感阵列,本文对手性生物分子进行了系统的研究,包括从氨基酸对映体识别到细菌肽聚糖生物合成监测,从单一蛋白质鉴别到疾病诊断再到复杂蛋白质组学研究,以及利用G-四链体DNA手性进行药物筛选,这对生物学研究、药物科学、医学诊断、生物医用材料等领域具有十分重要的意义。
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