厚壳贻贝和紫贻贝部分凋亡相关基因的克隆以及应对温度胁迫的表达特征

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贻贝是生活在潮间带的重要生物类群。近年来,随着全球气候变暖,贻贝的分布范围发生了变化。贻贝对温度生理上适应性的不同可能与其分布范围的变化紧密相关。但是温度胁迫对贻贝的影响及其响应温度胁迫的机制目前尚不清楚。本论文研究了温度胁迫对厚壳贻贝和紫贻贝血细胞DNA损伤的影响,并获得了细胞凋亡相关基因caspase-8,Rel,Bcl-2,Bax以及Cyto C基因的全长cDNA序列,分析了其结构特征、组织表达以及应对温度胁迫的表达变化,结果如下:(1)低温或者高温胁迫都能够使厚壳贻贝和紫贻贝血细胞中DNA单链损伤和双链损伤的程度增加,并且这种损伤的增加是依赖于时间和温度的。其中紫贻贝血细胞单链损伤对低温胁迫较为敏感,而厚壳贻贝的损伤程度在受到高温及低温胁迫后,均发生明显损伤。(2)厚壳贻贝caspase-8基因cDNA全长1884bp,包括1506bp的ORF,编码501个氨基酸;紫贻贝caspase-8基因cDNA全长1775bp,包括1488bp的ORF,编码495个氨基酸。序列分析显示两种贻贝caspase-8都包含DED结构域,CASPASEP20结构域和CASPASEP10结构域。Caspase家族特征蛋白序列KPKLFFIQACQG分别位于氨基酸348-359位和345-356位。厚壳贻贝和紫贻贝caspase-8基因在所检测的组织中有不同程度的表达,厚壳贻贝在外套膜中表达量最高,消化腺中表达量最低;紫贻贝在消化腺中表达量最高,肌肉中表达量最低。低温2℃胁迫,厚壳贻贝鳃,厚壳贻贝血,紫贻贝鳃中caspase-8酶活显著升高;低温6℃胁迫,紫贻贝鳃,紫贻贝血caspase-8 mRNA表达显著升高,厚壳贻贝鳃、血,紫贻贝鳃、血caspase-8酶活显著升高。高温28℃胁迫,厚壳贻贝鳃、血,紫贻贝血mRNA表达显著升高,厚壳贻贝鳃,紫贻贝鳃caspase-8酶活显著升高;高温32℃胁迫,厚壳贻贝鳃、血,紫贻贝鳃、血mRNA表达显著升高,厚壳贻贝鳃,紫贻贝鳃、血caspase-8酶活显著升高。(3)厚壳贻贝Rel基因cDNA全长2981bp,包括1788bp的ORF,编码595个氨基酸;紫贻贝Rel基因cDNA全长2985bp,包括1794bp的ORF,编码597个氨基酸。序列分析显示两种贻贝Rel都包含RHD结构域和IPT结构域。NF-κB家族Rel蛋白特征序列(FRYXCE)分别位于氨基酸的105-110位和107-112位。厚壳贻贝和紫贻贝Rel基因在所检测的组织中有不同程度的表达,厚壳贻贝在外套膜中表达量最高,在血液中表达量最低;紫贻贝在鳃中表达量最高,在消化腺中表达量最低。低温2℃胁迫,厚壳贻贝鳃Rel表达量显著升高;低温6℃胁迫,厚壳贻贝鳃,紫贻贝鳃Rel表达量显著升高;高温28℃胁迫,厚壳贻贝血,紫贻贝鳃Rel表达量显著升高;32℃胁迫,厚壳贻贝鳃、血,紫贻贝鳃、血Rel表达量显著升高。(4)厚壳贻贝Bcl-2基因cDNA全长784bp,包含558bp的ORF,编码185个氨基酸。序列分析显示厚壳贻贝Bcl-2包含BH42结构域和BCL2FAMILY结构域。厚壳贻贝和紫贻贝Bcl-2基因在所检测的组织中有不同程度的表达,厚壳贻贝和紫贻贝Bcl-2基因在性腺和鳃中的表达量较高,而在血液中表达量最低。低温2℃胁迫,厚壳贻贝血Bcl-2表达量显著升高;低温6℃和高温28℃胁迫,厚壳贻贝鳃、血,紫贻贝鳃、血Bcl-2表达量显著升高;高温32℃胁迫,厚壳贻贝血,紫贻贝鳃、血Bcl-2表达量显著升高。(5)厚壳贻贝Bax基因cDNA全长766bp,包含630bp的ORF,可以编码209个氨基酸。序列分析显示厚壳贻贝Bax包含一个BCL2FAMILY结构域。厚壳贻贝和紫贻贝Bax基因在所检测的组织中有不同程度的表达,厚壳贻贝Bax在消化腺和肌肉中的表达量较高,在鳃中表达量最低;紫贻贝Bax基因在外套膜和肌肉中的表达量较高,在血细胞中表达量最低。低温2℃胁迫,厚壳贻贝鳃、血,紫贻贝血Bax表达量显著升高;低温6℃和高温28℃胁迫,厚壳贻贝鳃、血,紫贻贝鳃、血Bax表达量显著升高;高温32℃胁迫,厚壳贻贝血,紫贻贝鳃、血Bax表达量显著升高。(6)厚壳贻贝Cyto C基因cDNA全长637bp,包含333bp的ORF,可以编码110个氨基酸。序列分析显示厚壳贻贝Cyto C包含一个CYTC结构域。Cys20和Cys23是血红素共价结合位点;His24是铁离子配体结合位点。厚壳贻贝和紫贻贝Cyto C基因在所检测的组织中有不同程度的表达,厚壳贻贝Cyto C基因在性腺和外套膜中的表达量较高,在血细胞中表达量最低;紫贻贝Cyto C基因在外套膜中的表达量最高,在消化腺中表达量最低。低温2℃胁迫,厚壳贻贝和紫贻贝鳃中Cyto C表达量显著升高;低温6℃胁迫,紫贻贝鳃、血Cyto C表达量显著升高;高温28℃胁迫,厚壳贻贝鳃、血,紫贻贝鳃、血Cyto C表达量显著升高。
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