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胃癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一,居男性恶性肿瘤发病率的第三位,女性恶性肿瘤发病率的第四位。包括中国在内的东亚地区是世界上胃癌发病率和死亡率最高的地区[1]。现代分子生物学的发展使我们认识到,恶性肿瘤的发生是一个多步骤、多阶段、进行性发展的复杂过程,由多基因、多因素、多分子参与。而抑癌基因的失活和癌基因的激活是肿瘤发生发展过程的重要事件。2000年,美国耶鲁大学病理科首次发现并命名SLP-2(stomatin-like protein2)基因。SLP-2属于stomatin基因超家族。人SLP-2(hSLP-2)基因定位于9p13.1,编码长约1500bp的信使RNA,SLP-2基因编码分子量为38537,含357个氨基酸的蛋白。研究显示,SLP-2蛋白是一种膜蛋白,是细胞骨架的组成部分,可能参与细胞膜离子通道的调控,从而影响细胞信号传导[2,3]。近期有研究显示,SLP-2蛋白还是一种线粒体相关蛋白,存在于细胞的线粒体内,可能对与其结合的线粒体膜相关蛋白起作用,调节其稳定性,并对ATP的合成产生一定影响[4,5]。近年来的研究表明,SLP-2基因在食管鳞癌[6-9]、肺癌[10-12]、子宫内膜癌[13,14]、乳腺癌[5,15]、结肠癌[16,18]、肝癌[19]、前列腺癌[20]等恶性肿瘤中都存在高表达。将SLP-2反义基因导入食管鳞癌、肺癌、子宫内膜癌及乳腺癌细胞系,发现SLP-2促进癌细胞的生长和增殖,并参与癌症的转移[5,8,9,11,13]。这些研究表明,SLP-2可作为一种备选的癌基因。但目前尚无有关SLP-2在胃癌中表达状况及对胃癌细胞作用的报导。因此,我们研究了SLP-2在胃癌组织中的表达状况以及SLP-2对胃癌细胞的影响,探讨SLP-2可能的作用机制。实验方法1. SLP-2mRNA及蛋白在胃癌和正常配对组织中的表达使用RT-PCR和IHC方法分别检测40对及60对胃癌及正常癌旁组织中SLP-2mRNA和蛋白的表达情况。并结合60例胃癌患者的临床病理资料,分析SLP-2蛋白表达与胃癌临床病理因素的关系。2. siRNA转染及效果检测用RT-PCR和western blot法检测人中分化胃癌细胞系SGC-7901中SLP-2mRNA及蛋白的表达。将SGC-7901细胞分为三组：转染SLP-2siRNA组、阴性对照组及空白对照组。设计并合成化学修饰SLP-2siRNA及阴性对照siRNA。通过阳离子脂质体转染试剂将化学修饰SLP-2siRNA.阴性对照siRNA分别转染至转染SLP-2siRNA组及阴性对照组,空白对照组仅加入转染试剂。用RT-PCR和westernblot法检测转染后各组SGC-7901细胞中SLP-2mRNA及蛋白的表达情况。3. SLP-2siRNA对体外胃癌细胞系增殖能力的影响使用MTT方法检测转染后各组SGC-7901细胞的增殖力,检测细胞吸光度值(A490值),计算转染SLP-2siRNA组相对于阴性对照组和空白对照组的生长抑制率,绘制细胞生长曲线。4. SLP-2siRNA对体外胃癌细胞系细胞周期和凋亡率的影响采用FCS方法检测转染后各组SGC-7901细胞的细胞周期和凋亡率,计算各组细胞增殖指数。5. SLP-2siRNA对体外胃癌细胞系侵袭力和迁移力的影响将转染后各组SGC-7901细胞加入聚碳酯膜覆盖有Matrigel的Transwell小室内孵育24h,观察细胞侵袭力。或将转染后各组SGC-7901细胞直接加入Transwell小室内孵育24h,观察细胞迁移力。显微镜检测穿膜细胞数,计算转染SLP-2siRNA组相对于阴性对照组和空白对照组的侵袭抑制率和迁移抑制率。6.人胃癌裸鼠移植瘤模型的建立及移植瘤的处理在裸鼠左侧近腋窝处皮下接种SGC-7901细胞(1x107个／只),建立裸鼠移植瘤模型。随机分为转染SLP-2siRNA组,阴性对照组和空白对照组,每组5只,于肿瘤局部分别多点注射化学修饰SLP-2siRNA、阴性对照siRNA、生理盐水。每3天一次,共5次。7. SLP-2siRNA对体内胃癌细胞增殖及凋亡的影响每隔2天检测1次裸鼠的移植瘤体积及裸鼠体重,根据测量数据绘制移植瘤生长曲线。15天后处死裸鼠,取出移植瘤,HE染色后镜下观察移植瘤组织学特征,计数肿瘤细胞凋亡数量。观察肝脏和肺部的转移灶。8. SLP-2siRNA对体内胃癌细胞SLP-2mRNA及蛋白表达的影响使用IHC法检测各组移植瘤组织中SLP-2蛋白的表达,使用RT-PCR法检测各组移植瘤组织中SLP-2mRNA的表达。统计学分析采用SPSS16.0软件进行统计学分析。计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示。采用X2检验,t检验及方差分析,组间比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1. RT-PCR和IHC方法显示,胃癌组织中SLP-2mRNA和蛋白的表达均高于配对癌旁正常胃组织(P均<0.05),且SLP-2蛋白的表达增高在较晚期、有淋巴结转移胃癌病例中更为明显(P均<0.05)。2.经RT-PCR和westernblot法检测,转染SLP-2siRNA组SGC-7901细胞中SLP-2mRNA和蛋白表达水平均低于阴性对照组及空白对照组(P均<0.05)。3.MTT法检测显示,与阴性对照组及空白对照组相比,转染SLP-2siRNA组的SGC-7901细胞生长受到抑制(P<0.05)。4.流式细胞检测显示,与阴性对照组及空白对照组相比,转染SLP-2siRNA组的SGC-7901细胞G1期细胞比例增加(P<0.05)；细胞增殖指数PI降低(P<0.05)；细胞凋亡率无明显变化(P>0.05)。5. Transwell检测显示,与阴性对照组及空白对照组相比,转染SLP-2siRNA组的SGC-7901细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均减少(P均<0.05),相对于阴性对照组和空白对照组,迁移抑制率分别为30.08%和32.40%,侵袭抑制率分别为32.65%和27.11%。6.裸鼠移植瘤实验显示,三组裸鼠体质量无明显差异(P>0.05)。与阴性对照组及空白对照组相比,转染SLP-2siRNA组的移植瘤体积减小(P<0.05)。抑瘤率分别为26.74%和30.15%。7.三组移植瘤组织均呈人中分化胃腺癌的表现。三组移植瘤细胞凋亡数及凋亡指数无明显差异(P均>0.05)。三组裸鼠均未发现有肝脏和肺部转移灶。8. RT-PCR和IHC检测显示,转染SLP-2siRNA组的裸鼠移植瘤中SLP-2mRNA和蛋白表达水平均低于阴性对照组和空白对照组(P均<0.05)。结论1. SLP-2mRNA和蛋白在胃癌组织中的表达升高,且SLP-2蛋白的表达增高在较晚期、有淋巴结转移胃癌病例中更为明显。2. SLP-2siRNA能抑制体外胃癌细胞SGC7901的增殖、迁移力和侵袭力,使细胞阻滞在G1期,但对细胞凋亡无明显影响。SLP-2基因可能参与促进胃癌细胞增殖、侵袭及转移。3. SLP-2siRNA可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长,但对细胞凋亡无影响,提示SLP-2基因参与促进胃癌细胞增殖。4.我们研究证实了SLP-2基因在胃癌组织中高表达,SLP-2siRNA对体内外胃癌的增殖及其肿瘤特性有抑制作用,提示SLP-2基因可能参与胃癌的发生发展,但SLP-2基因在恶性肿瘤中的作用机制仍需进一步研究。