研究背景:由于外伤、手术、先天畸形等原因造成的大量软组织缺损,是整形外科常见的临床问题之一。经历了皮瓣移植,异种、异体组织来源填充物,以及人工合成的填充材料,自体脂肪组织因无免疫源性和自然的形态质地等优势,而成为最为理想的软组织填充材料。然而有关自体脂肪移植的诸多尝试,终因脂肪细胞液化坏死、钙化、纤维化以及高吸收率等原因限制了其临床应用。许多研究关注了脂肪组织坏死吸收的成因,其中Yoshimura的研究表明,移植后脂肪组织的大血管结构和血管周围细胞成分明显减少,认为以脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ASCs)为主的基质血管成分细胞群(stromal vascular fraction,SVF)的减少是导致脂肪组织重吸收的关键因素。以此为理论基础发明的细胞辅助的脂肪移植技术(cell assisted lipotransfer,CAL)一定程度上提高了游离脂肪移植物中脂肪干细胞的比例,进而提高了成活率,然而效果仍未达到理想。为了进一步提高移植脂肪组织的成活率,研究移植物中细胞的浓度对成活率的影响是值得进一步探索的课题之一。在游离脂肪移植之后,脂肪来源干细胞的应用能够避免移植物的坏死吸收。然而ASCs不可避免会面临数量不足及增殖过程中的老化问题。脐带间充质干细胞(umbilical cord masenchymal stem cells,UCMSCs)恰好弥补了上述种种缺陷,具备增殖分化活力高不易老化,数量多,易获取而且不引起免疫排斥反应等优点,提示脐带干细胞极有可能会成为成体干细胞的良好替代。脐带干细胞是否能够替代脂肪干细胞提高移植脂肪成活率,是本课题研究的内容之一。诸多研究中,游离脂肪移植之后的再血管化被认为是脂肪成活的机制。脂肪干细胞能够提高成活率也是因为促进了血管生成。血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)是形成血管最不可缺少的细胞。综上,我们直接在脂肪移植物中添加血管内皮细胞,研究其在游离脂肪移植中促进血管生成的作用,对内皮细胞辅助游离脂肪移植的临床应用提供指导。实验目的:1.探讨不同的脂肪干细胞浓度对于移植物转归的影响;2.采用脐带间充质干细胞辅助游离脂肪移植,检验其能否作为脂肪干细胞的替代来辅助游离脂肪移植;3.对比研究脂肪干细胞、脐带间充质干细胞对游离脂肪移植作用的差异,并深入研究其促进血管化的机制;4.研究血管内皮细胞应用于游离脂肪移植对于成活率的影响,并探讨内皮细胞浓度和脂肪成活之间的相互关系。实验方法:1.体外培养扩增后的脂肪干细胞,以不同的浓度与脂肪组织混合移植于裸鼠皮下。在1周、1个月、2个月时取材观察移植物的大小、重量、组织学及real-timepcr检测移植物中的血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)及成脂转录因子(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma,ppar-γ)表达。2.脐带间充质干细胞混合脂肪颗粒,移植于裸鼠皮下,1周、1个月、2个月时取材观察移植物的大小、重量、组织学及real-timepcr检测移植物中的vegf、ppar-γ基因表达。3.脐带间充质干细胞与脂肪干细胞以相同数量辅助游离脂肪移植,1周、1个月、2个月后比较移植物重量、免疫荧光染色观察组织内血管生成、real-timepcr检测vegf、ppar-γ及白细胞介素-8(interleukin-8,il-8)表达。收集两种干细胞的上清液,测定其细胞因子:il-8、白细胞介素-6(interleukin-6,il-6),肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α),肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,hgf)、vegf的浓度,以研究两种干细胞对游离脂肪移植的作用差异。4.从脂肪组织中分离提取血管内皮细胞,经量子点标记后辅助游离脂肪移植,1周、1个月、2个月后取材观察移植物的大小、重量,采用real-timepcr技术检测移植物中的vegf、血管内皮标志物cd31、vwf基因表达,以及免疫荧光染色技术观察标记细胞的转归。实验结果:1.脂肪干细胞辅助游离脂肪移植后1周、1个月、2个月取样观察发现,添加了脂肪干细胞的实验组移植物大小和重量都显著高于单纯脂肪移植组。real-timepcr检测结果证实实验组内ppar-γ、vegf表达增高,且移植物重量以及ppar-γ、vegf基因表达与细胞浓度呈正性依赖关系。2.将脐带间充质干细胞与脂肪组织混合后移植于裸鼠皮下,移植后1周、1个月、2个月取样观察测定,与单纯脂肪移植的对照组相比,脐带间充质干细胞显著降低了移植物内细胞因子il-8的表达,然而移植物的大小和重量观测结果的差异无统计学意义。3.通过对比脐带间充质干细胞与脂肪干细胞对游离脂肪移植的促进作用发现,脂肪干细胞能够更显著的增大移植物体积、质量,促进移植物内粗大血管形成和相关基因(ppar-γ、il-8)表达,与脐带间充质干细胞相比差异具有统计学意义,且脂肪干细胞分泌更高水平的细胞因子il-6、il-8、tnf-α、vegf、hgf。4.脂肪来源的血管内皮细胞与脂肪组织混合移植于裸鼠皮下,移植后1周、1个月、2个月分别取样观察分析发现,脂肪来源血管内皮细胞能够在移植后的早期形成血管结构,增加移植物的重量、血管密度以及提高vegf、cd31、vwf基因表达,且以上结果与添加细胞的浓度呈正性依赖效应。结论:1.增加脂肪干细胞的浓度能够显著提高移植物成脂分化及血管化水平,提高移植物的长期存活率。2.脐带间充质干细胞虽然具备良好的增殖分化能力,但其成脂分化及促进血管生成能力较弱,减少移植脂肪的液化吸收有限,辅助游离脂肪移植的效果仍存在疑虑。3.脂肪干细胞由于具有辅助血管生长,旁分泌细胞因子促进血管生成,提高移植物成脂分化等能力,辅助游离脂肪移植的效果明显优于脐带间充质干细胞。4.内皮细胞能迅速重建移植物血供,提高血管密度,且其作用与内皮细胞浓度成正性依赖效应,从而可以作为辅助游离脂肪移植的细胞来源。