植物甾醇除可以作为合成甾体激素的原料,还具有降血清胆固醇、降血脂、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等作用,广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。植物甾醇主要来源于植物油精炼下脚料,特别是脱臭馏出物中。脱臭馏出物一般含有30%~60%游离脂肪酸、10%~20%甘油酯、10%~35%甾醇、1%~20%生育酚、10%~15%烃。脱臭馏出物主要成分的理化性质相差很小,因此从中分离提取植物留醇非常困难。目前植物甾醇生产方法为甲酯化一分子蒸馏法,其生产原理是首先以浓硫酸作为催化剂将脂肪酸甲酯化为低沸点的脂肪酸甲酯,然后再通过分子蒸馏和结晶将留醇从脱臭馏出物中提取出来。此法的缺点是流程长、操作步骤多、产品的纯度和收率比较低、成本高;使用大量浓硫酸、氢氧化钠、甲醇,腐蚀设备,污染环境。针对甲酯化工艺存在的问题,根据留醇通常不是微生物生长代谢的底物及不溶于水的性质,作者设想是否可以通过特定的微生物发酵,将脱臭馏出物中与甾醇交联在一起的脂肪酸及甘油酯作为底物消化掉,促使甾醇释放到发酵液中,从而实现甾醇与脱臭馏出物其它成分的简单分离。因此,本课题开展了采用微生物发酵法来分离、提取脱臭馏出物中植物甾醇的研究。用于脱臭馏出物发酵的理想微生物菌种应为:(1)能高效代谢利用脱臭馏出物中的游离脂肪酸及甘油酯;(2)菌体本身其他工业价值如单细胞蛋白。因此,选择了产朊假丝酵母(Candida utils)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、扣囊复膜孢酵母(fbflugera)、白地霉(Geotrichumcandidum)为研究对象,研究了它们在以脱臭馏出物为主要成分的固体培养基上的生长情况,从中筛选出了热带假丝酵母(Candida tropicalis)作为脱臭馏出物发酵的适宜菌种。以脱臭馏出物为发酵培养基的唯一碳源,研究了热带假丝酵母的菌体生长、脱臭馏出物中脂肪酸消耗和溪醇释放。试验结果表明,热带假丝酵母酵发酵大豆脱臭馏出物的最适培养基为:脱臭馏出物40 g/L,酵母浸粉20g/L,MgSO40.1g/L,KH2PO4 0.25 g/L;其最适发酵条件为:培养基初始pH6.0,接种量12%,摇床转速200 r/min,发酵温度30℃。在最适条件下,菌体湿重67g/L、脂肪酸消耗率33%、植物留醇的释放率42%。试验发现培养基中不宜添加乳化剂。外加Co2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+对热带假丝酵母生长均有抑制作用,其中Mn2+离子的抑制作用最为严重,而Mg2+可以明显促进热带假丝酵母的生长。脱臭馏出物中通常还含有100%～15%烃。如果能通过微生物生长代谢除去这些烃,应有利于植物甾醇的提取。因此,本课题使用一株解烃菌,即红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)来发酵大豆脱臭馏出物,并研究了发酵条件对其菌体生长、脂肪酸消耗和甾醇释放的影响。试验结果表明,红平红球菌发酵大豆脱臭馏出物的最适培养基为:其最适发酵条件为:脱臭馏出物40g/L、酵母浸粉20g/L、MgS040.1Og/L;其最适发酵条件为:培养基初始pH7.0,接种量为12%,摇床转速220 r/min,发酵温度30℃。在此发酵条件下,菌体湿重39g/L、脂肪酸消耗率25%、植物甾醇的释放率34%。试验发现,红平红球菌除能代谢利用烃外,也可利用脂肪酸。从分离提取植物留醇的角度分析,红平红球菌的发酵效果差于热带假丝酵母。但将两种菌进行混合发酵时,发酵效果低于单菌(热带假丝酵母),其原因有待进一步分析。热带假丝酵母发酵大豆脱臭馏出物后,其中的植物甾醇释放到了发酵液中并与大量的酵母细胞混合在一起。本课题尝试了滤纸、石英砂、硅藻土、有机膜等物理过滤方法来分离植物留醇,但分离效果均不理想。先采用加热、超声波处理、絮凝进行预处理再进行物理过滤,仍未实现植物留醇与酵母细胞的分离。经过摸索,最终研发出来了发酵液中植物甾醇的物理化学提取法,其具体工艺为:脱臭馏出物发酵液→离心→沉淀→乙醇萃取→真空蒸发浓缩→气流干燥→植物甾醇粗品。本课题还研究了离心速度、乙醇溶液浓度、萃取时间和萃取温度对提取植物甾醇的影响。试验结果表明,物理化学法提取植物甾醇的最佳工艺为:离心速度4000 r/min,乙醇浓度100%,萃取时间30min,萃取温度30℃。在此条件下,粗甾醇的纯度为72%,其收率为90%。本课题首次尝试采用微生物发酵的方式来从脱臭馏出物中分离植物甾醇,并成功地从发酵液中提取出来了粗甾醇。尽管采用热带假丝酵母发酵可以将脱臭馏出物中脂肪酸及甘油酯吸收消化掉,从而将甾醇分离出来,但拐醇的释放率较低,仍有较多沼醇残存在脱臭馏出物中。因此,如何提高甾醇的释放率是将是未来工作的重点。此外,甾醇的提取方法也有待进一步改进。