CRISPR是一种特殊的DNA序列重复家族,是细菌和古细菌在进化中形成的一种免疫防御系统。在CRISPR基因座的附近区域存在着一个被称为Cas蛋白的家族,它起着对外源核酸切割的功能。CRISPR/Cas9系统主要由重复序列、间隔序列(protospacers)和重复序列上游的Cas蛋白家族构成。CRISPR/Cas9系统主要有I、II、III三种类型,II型CRISPR/Cas9系统由于其构造简单,备受研究者青睐并将其改造成为对哺乳动物基因组DNA进行靶向修饰的工具,该系统对靶序列的切割只需要二聚体结构的单链导向RNA(sgRNA)和Cas9蛋白,gRNA通过引导Cas9识别含有PAM(NGG)的靶基因序列,对靶基因DNA进行双链切割,从而为同源重组介导的基因敲除制造可能。肌肉生长抑制素(myostatin MSTN)是一种分泌性多肽,属于TGF-β超家族成员,具有该家族共有的生物结构。MSTN基因是骨骼肌的负调控因子,主要通过调节哺乳动物成肌细胞的增殖影响肌肉的生长和发育。自然状态下的生物学突变以及利用基因敲除技术敲除MSTN基因的动物的肌肉量会急剧增加,产生双肌性状,生活中我们接触到的比利时蓝种牛和皮德蒙特牛的双肌性状性状属于MSTN基因突变。MSTN基因突变的“双肌性状”能够大大的改善世界畜牧业的现状,对提高畜牧的瘦肉率,加快出栏周期具有重要的意义。同时,在生物医药行业,利用MSTN突变,为治疗某些肌肉萎缩、肌肉发育不良提供了可能性。同时研究发现MSTN基因可以抑制脂肪的生成,这对于治疗肥胖和糖尿病有着非常重要的意义。猪肉作为我国主要的肉类供应来源,与人们的生活有着紧密的联系,而且猪在生理、组织结构、解剖分析、营养代谢等方面与人类极为相似,非常适合作为动物疾病模型去研究人类疾病。因此能够采用基因定点突变的方法产生MSTN基因突变猪对于畜牧业育种改良、加快猪生长周期、制备模型动物等有着非常重要的意义。本研究通过选取MSTN基因上第一外显子的T1靶位点和第三外显子的T2靶位点作为打靶对象。在制作打靶载体方面,以HRX-2MCS载体作为骨架载体,HRX-2MCS载体上有着绿色荧光蛋白基因和G418抗性基因可以作为正筛选,红色荧光蛋白基因作为负筛选。通过HRX-2MCS载体上的多克隆位点将靶序列的同源左右臂克隆到载体上制成供体载体dT1和dT2,并通过公司制作含有T1、T2靶位点的Cas9蛋白酶系统的载体T11和T21。采用电穿孔转染方法将打靶系统(dT1和T11、dT2和T21)转入到PK-15细胞系中,通过G418和绿色荧光蛋白的正筛选作用和红色荧光蛋白的负筛选作用,挑选出单克隆细胞系。提取单克隆细胞系基因组DNA,通过设计引物PCR检测和产物测序的方法检测克隆斑,我们得到T1位点阳性克隆斑细胞系29个,T2位点阳性克隆斑细胞系26个。综上所述,本研究证实,利用CRISPR/Cas9基因敲除技术制备MSTN基因突变动物模型存在着可能。