代谢工程(metabolicengineering)是指通过基因工程的手段有目的地修饰一个物种中某一代谢途径，或引入一新的代谢途径，以达到提高或降低某种代谢产物的合成水平，或使被修饰物种产生某种新的代谢产物的操作。代谢工程有着极强的目的性，它着眼于某种特定的代谢产物对于人们生产和生活所具有的应用价值，旨在使基因工程技术更直接的服务于人们的需要，是转基因技术中十分重要和有意义的领域。异黄酮是仅存在于豆科植物中的一种黄酮类次生代谢产物，是大豆及豆制品中的重要营养成分之一，具有预防骨质疏松、更年期综合症及多种癌症的保健效果。本研究尝试利用转基因技术，以过表达和反义基因抑制等策略，将异黄酮合成途径引入非豆科植物，使之产生一种典型的大豆异黄酮——染料木素(genistein)。主要研究结果包括以下五个方面： 1，大豆IFS基因的克隆及其在非豆科植物中生成genistein的作用：根据数据库中已知序列从大豆基因组中克隆得到异黄酮合酶(isoflavonesynthase，IFS)的基因，将它置于植物双元表达载体pCAMBIA3301中CaMV35S启动子的驱动之下得到载体p3301-IFS，以农杆菌介导的方式转化烟草、矮牵牛和生菜。通过薄层层析(TLC)和高效液相层析(HPLC)法在转基因烟草花瓣、转基因矮牵牛叶片和花瓣，以及转基因生菜叶片中都检测到genistein的积累；电喷雾离子化质谱分析(ESI-MS)进一步证实了产物的确是genistein。 2，蒙古黄芪AmPAL1基因的克隆及其对合成genistein的促进作用： 利用RT-PCR和5-RACE技术从一种豆科植物蒙古黄芪(AstragalusmembranaceusvarMongholicus)中分离得到一个新的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase，PAL)基因，定名为AmPAL1(GenBank中序列号为AY986506)。我们通过Southern杂交对AmPAL1在蒙古黄芪基因组中的拷贝数进行了分析，发现它以三个拷贝的多基因家族存在。又以Northern杂交分析AmPAL1的表达，发现它在蒙古黄芪的根、茎、叶中都有高水平的表达，而且它的表达明显受到UV照射和机械损伤的诱导，白光照射黄化苗也会强烈诱导它的表达。PAL是植物黄酮类物质合成途径的第一个酶，亦是一个关键酶，它的活性可以影响黄酮类物质的合成。将AmPAL1转化烟草和生菜能够提高转基因植物中总黄酮的含量。我们又将AmPAL1置于CaMV35S启动子驱动之下，与IFS一同连入载体pCAMBIA3301，构建了含有两个外源基因的植物双元表达载体p3301-IFS/PAL。转化p3301-IFS/PAL的烟草花瓣和生菜叶片中genistein的含量都比仅表达IFS的对照明显升高，说明过量表达的PAL可以协助IFS起作用，这一作用很可能是通过提高了可被IFS利用的底物的量而实现的。 3，F3H基因对genistein生物合成的影响： 由于黄烷酮3-羟化酶(flavanone3-hydroxylase，F3H)与异黄酮合酶IFS共用相同的底物，降低F3H的活性可能会增加可供IFS利用的底物的量，从而提高genistein的产量。我们将拟南芥F3H的反义基因置于CaMV35S启动子驱动之下，并与IFS一同连入载体pCAMBIA-3301，构建了同样含有两个外源基因的植物双元表达载体p3301-IFS/F3HR并转化烟草。反应基因成功抑制了烟草内F3H的表达，同时转基因烟草花瓣中genistein的产量也比只转化IFS的对照有了明显提高。 4，一种MYB转录因子对苯丙烷类代谢途径的影响： 前人研究表明，植物中黄酮类化合物以及花青素(黄酮类代谢途径的终产物之一)合成途径中多个酶的基因表达受到MYB类转录因子的统一调控，因此，如果能够利用转录因子激活整个黄酮类代谢途径，在此基础上再引入IFS，理应比仅引入IFS得到更多genistein的积累。我们试图通过将一个来自玉米的MYB转录因子和螺旋-环-螺旋结构的辅助因子融合而成的转录因子引入烟草来激活黄酮类代谢途径，然而结果却出乎我们的预料，转基因烟草中此代谢途径上的PAL和查尔酮合酶(chalconesynthase，CHS)的基因表达都受到了抑制，总黄酮含量也有显著下降。这一结果有待进一步探讨。 5，向豆科植物中引入外源IFS基因的尝试： 虽然在我们得到的转基因植物中的确有genistein的积累，但其含量约比大豆种籽低2-3个数量级，因此目前还未能达到具有实际利用价值的水平。我们又试图将大豆IFS转化入一些豆科植物中进行过量表达。在自身能够合成异黄酮的豆科植物中黄酮类物质代谢途径处于活化状态，具有可被IFS利用的底物，因此过量表达IFS可以期望得到较高的异黄酮产量。我们选择了大豆、柠条和葫芦巴作为转基因材料，摸索了愈伤组织培养条件，转化工作还在进行之中。