肽聚糖是细菌细胞壁特有的基本组成成分,在维持细胞特定形状、保护细胞免受内部膨胀压破坏和参与细菌的生长和分裂过程中起重要作用。阐明细菌细胞壁肽聚糖的组织结构,是微生物学研究中的基本问题。解释清楚其结构对于研究细菌的生长和分裂机制、胞外聚合物与细胞壁的锚接形式、抗生素靶点的选择以及仿生学等都有重要意义。肽聚糖是由聚糖链和肽链组成的种类繁多、变化复杂的超分子复合物。到目前为止,细菌细胞壁肽聚糖主要的拓扑结构模型有:层状晶体模型、脚手架模型和卷曲螺旋模型等。尽管进行了多年的研究,细菌细胞壁肽聚糖的结构仍然没有完全了解清楚。原子力显微镜（atomic force microscopy,AFM）技术是一种直观有效的研究肽聚糖超分子结构表面形貌的方法。多种细菌如大肠杆菌(Escherichiacoli、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的肽聚糖等已经得到了较为详细的AFM表面形貌研究。但是肽聚糖结构的多样性,使得不同种属的细菌之间,同种不同株的细菌之间,甚至同一株细菌在不同的生长环境和生长时期下的肽聚糖结构都有不同。目前对各种细菌肽聚糖形貌的研究数据仍然较少,对于阐明其架构仍远远不够。本文以典型的革兰氏阳性杆菌——枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和典型的革兰氏阳性球菌——沃氏葡萄球菌（Staphylococcuswarneri）为研究材料,通过 AFM、透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscopy,TEM）等多种研究手段对两株细菌的细胞壁侧壁和分裂板处肽聚糖的超微结构形貌进行了多方面的研究,取得了如下研究成果:一.枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis侧壁和分裂板肽聚糖高分辨率结构研究利用AFM对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌（B.subtilis AS1.398）的肽聚糖结构进行观察分析,研究了其不同生长阶段的肽聚糖在纳米尺度上的高分辨率形貌结构。首先提取了不同生长时期下完整细菌的细胞壁肽聚糖,通过测量其长度发现,在稳定生长期该菌的菌体平均长度是2.72±0.63 μm（n=60）,而在指数生长中期为3.78±1.28 μm（n=70）。指数生长期菌体长度大于稳定期（p<0.05）。同时发现B.subtilis AS1.398的侧壁肽聚糖在纳米尺度上的高分辨率结构从指数生长期的相对不规则状,逐渐转变为稳定期的绳索状（cable）结构。且“cables”的平均宽度为29.11±5.79nm（n=32）,远小于之前文献中报导的另一株芽孢杆菌B.subtis 168HR的cable宽度（～50nm）。研究发现细胞壁侧壁肽聚糖的厚度不是固定的,而是与细菌的生长状态有关。在指数生长中期,细胞壁的平均厚度为 12.59±0.89 nm（n=59）,在稳定生长期为 14.44±0.92 nm（n=52）,从指数期到稳定期略有增加（p<0.05）。细菌的分裂板（septa）由同心环状结构组成,且表面结构没有类似于侧壁的清晰细节结构,分裂板中部存在较薄的内部前缘,可能是分裂板形成的重要前导结构。该部分结果揭示了来自不同枯草芽孢杆菌菌株的肽聚糖结构的细微差异,拓展了我们对枯草芽孢杆菌肽聚糖的结构特征的了解。二.枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis端部半球状形貌的形成机制研究细胞壁在细菌菌体的形状维持中起着关键作用,杆状细菌菌体的细胞壁在几何结构上由一个圆筒状侧壁和两个半球状端部组成,其中,筒状侧壁的结构建成和形状维持的机制已经得到了深入研究,但是其半球状端部的形貌建成和维持机制并不清楚。为了了解杆状细菌端部的形貌及形成机制,我们通过AFM和电子显微镜等技术手段对枯草芽孢杆菌的端部结构进行了研究。结果发现,正常细菌菌体的端部以半球形存在,且端部与筒状侧壁的连接处有环脊带结构;当完整的细胞壁被分离提取出之后,通过TEM超薄切片观察研究发现:细胞壁端部的曲率大大减小,呈现出平整的端部结构。AFM研究结果也证实了分离得到的细胞壁端部并非半球状结构,而是平整的圆盘状结构。据此推测,细菌端部细胞壁具有一定的弹性,在无内压的松弛状态下为平整的圆盘状结构,而在完整菌体中,在内部压力的作用下,平整的圆盘状端部细胞壁转变为半球状结构。为进一步验证该猜测,我们对细菌进行了高渗溶液处理,以降低其内压对细胞壁的作用。研究结果发现高渗溶液处理后的菌体发生了部分质壁分离,在这种情况下,菌体端部结构的曲率降低,由半球状转变成平整状;当将高渗处理的菌体进行低渗处理后,细菌重新变得饱满,菌体的端部又转变回半球状结构。我们的研究显示B.subtilis菌体端部的细胞壁具有一定的弹性,在其由平整的圆盘状结构转变为半球状结构的变化过程中,菌体内部压力起重要作用。该部分研究工作让我们对B.subtilis细胞壁端部的结构有了新的认识,为内部压力可能在菌体端部的半球状结构的形成中起重要作用提供了切实的实验证据。三.沃氏葡萄球菌Staphylococcus warneri细胞壁肽聚糖超微结构研究为探究球状细菌细胞壁肽聚糖的超微结构,我们对典型的球状革兰氏阳性细菌S.warneri的细胞壁肽聚糖进行了分离提取,并通过AFM进行了观察研究。结果发现S.warneri的结构形貌与S.aureus相似,其细胞壁肽聚糖上的带状的“rib”结构可以区分不同代际间的新老细胞壁,新细胞壁（Ⅰ型）呈同心圆环状结构,且排列紧密,厚度为10.21±1.52 nm（n=60）;老细胞壁（Ⅲ型）呈松散的斑点状结构,厚度为21.37±1.87nm（n=30）;在新老细胞壁中间的过渡态（Ⅱ型）呈略显散乱的线状结构,厚度跨度较大,在15～20nm之间（n=37）。我们利用高效降解革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖中的肽链的蛋白酶pseudoalterin对从S.warneri中提取的肽聚糖进行酶解处理,去除掉肽聚糖中的绝大部分肽链,使用AFM液相和气相扫描模式进行成像观察研究,结果发现在S.warneri细胞壁的肽聚糖组成中存在超长糖链,HPLC分析进一步证实了该结果。Ⅰ型细胞壁呈现较长的线性聚糖链结构,结构规整;Ⅱ型细胞壁由粗点连接成不规则的“珠串”结构;Ⅲ型老细胞壁呈弥散的点状结构,在酶解过程中易弥散。我们原位观察到细菌细胞壁中超长糖链的存在,这在细胞壁肽聚糖的AFM观察中尚属首次,同时也验证了葡萄球菌属中不同种间肽聚糖结构存在差异。四.沃氏葡萄球菌Staphylococcus warneri细胞壁分裂板（septa）结构的研究分裂板是革兰氏阳性菌细胞分裂的重要结构。我们分离了 S.warneri细胞壁肽聚糖,包括分裂板和细胞壁组分,并利用AFM对闭合和未闭合的分裂板（包括完整和破碎的样品）进行了详细的研究观察。研究结果为S.warneri分裂板的双层结构提供了充分的证据,为其力学崩解的分裂机制提供了结构基础。尽管分裂板的双层结构可由机械力分开,但该双层结构在未闭合分裂板的内缘在是连接在一起的。双层结构内表面的肽聚糖呈同心圆环状结构,而分裂板肽聚糖的外表面相对无细节结构特点。分裂板肽聚糖的空间架构在其分裂转化为新的细胞壁时得以保留。进一步分析发现,分裂板是一个不完全闭合结构,会存在一个中部凹陷。而此中部凹陷结构会影响下一个细胞周期中新分裂板的形成。从结构分析中发现单细胞水平上细菌的细胞周期有多样性,新分裂板在老分裂板上形成的现象表明,新细胞周期在上一个细胞周期未结束时就已经开始。此外,所有分离出的新细胞壁都是扁平结构,表明新形成的细胞壁具有较大的弹性,而内部压力在细菌分裂后细胞壁的形状变化中起作用。五.深海细菌Zunongwangia prounda SM-A87荚膜多糖产量的单细胞水平检测我们利用AFM技术在单细胞层面研究了分离自深海沉积物的产荚膜多糖菌株Z.profunda SM-A87在不同培养温度下的荚膜多糖产量。Z.profunda SM-A87在10℃下生长速率要低于在最适生长在温度（30℃）下的生长速率。但是在10℃培养时其荚膜多糖产量高于在30℃培养下的多糖产量。利用AFM单细胞成像技术,发现两种温度下Z.profunda SM-A87菌体都是杆状形态,但菌体在10℃下有丝状形态存在。同时我们观察了环绕细菌菌体的荚膜多糖的超微形貌,发现多糖纤维纠缠成网状结构。随着培养时间的增长,整个多糖覆盖范围和多糖纤维长度都会增加。我们统计了细菌菌体和其所产生的荚膜多糖的平均体积。单个细菌菌体的体积是0.2～0.3μm3,单细胞荚膜多糖的平均体积随着细菌生长而增加。胞外多糖产量在10℃稳定期下增加至每细胞0.097±0.051 μm3,高于30℃时的产量值（每细胞0.055 ± 0.013 μm3）。该部分研究工作开发了一种新的利用AFM测量细菌平均荚膜多糖产量的方法。由于产荚膜多糖菌株在深海环境中广泛存在,该方法对于研究荚膜多糖在深海菌株环境适应中的作用有潜在使用价值。