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目的:1.检测NIRF蛋白和HBV核心蛋白在人正常肝组织和HBV感染的肝组织内表达的相关性;检测人正常肝组织和肝癌组织中NIRF基因的蛋白表达情况;2.构建NIRF基因真核表达载体,并转染人胚肾上皮细胞HEK-293;3.构建好的重组载体转染能分泌HBV DNA的HepG2.2.15细胞,观察NIRF蛋白与HBV核心蛋白在细胞内的定位。方法:1.通过免疫组化方法检测人正常肝组织(n=25)、HBV感染的肝组织(n=25)中NIRF蛋白和HBV核心蛋白表达的相关性,并分析NIRF基因的蛋白表达是否有差异;通过免疫组化方法检测人正常肝组织(n=25)、肝癌组织(n=25)中NIRF基因的蛋白表达情况;2.通过RT-PCR方法,从人肝癌组织中获得NIRF基因,将其插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建成重组载体pIRES2-EGFP-NIRF,并转入大肠杆菌DH5α,筛选出含有正确插入片段的克隆,经PCR、酶切及DNA测序鉴定;实验分三组:HEK-293 - NIRF组(利用脂质体将构建成功的重组载体转染HEK-293细胞)、HEK-293-Null组(空载体转染HEK-293细胞)、HEK-293组(未转染的HEK-293细胞);采用PCR技术和Western blotting方法分别检测三组中NIRF mRNA及蛋白水平的表达,成功建立细胞转染模型; 3.构建好的重组载体pIRES2-EGFP-NIRF转染能分泌HBV DNA的HepG2.2.15细胞,通过免疫荧光检测NIRF蛋白和HBV核心蛋白在细胞内的定位。结果:1.通过免疫组化法检测蛋白的表达,发现NIRF蛋白含量与HBV核心蛋白(HBV-CP)含量呈正相关;人肝癌组织中NIRF蛋白表达明显高于在人肝正常组织中的表达;2.利用酶切、PCR分析、DNA测序证实,重组载体即NIRF真核表达载体pIRES2-EGFP-NIRF构建成功;经PCR和Western blotting证实,人胚肾上皮细胞HEK-293中无NIRF的转录及翻译,是进行NIRF转染的良好细胞模型,重组载体转染HEK-293细胞后,经PCR和Western blotting证实转染成功;3.重组载体pIRES2-EGFP-NIRF转染能分泌HBV核心蛋白(HBV-CP)的HepG2.2.15细胞,通过免疫荧光实验发现NIRF蛋白和HBV核心蛋白(HBV-CP)在细胞内有共同的亚细胞定位。结论:NIRF具有泛素化能力,HBV-CP的第7位和第96位Lys残基具有被泛素化的分子基础;在肝细胞内NIRF的含量与HBV-CP的含量高度相关,并且在原发性肝癌中NIRF蛋白表达增加;真核表达载体pIRES2-EGFP-NIRF转染HepG2.2.15细胞,可发现NIRF蛋白和HBV核心蛋白(HBV-CP)在细胞内有共同的亚细胞定位。我们可以推测NIRF可能是HBV-CP的一个E3 ligase,由此探索NIRF影响HBV病毒在素主细胞内的组装、成熟和对外分泌的机制,最终为乙型肝炎的临床治疗找到一条新的途径。