目的：肿瘤细胞过度增殖及转移是肿瘤发生和发展过程中的重要特征,也是肿瘤研究的重点和肿瘤治疗的关键靶点。本课题分别以胰腺癌和黑色素瘤细胞为模型,研究抑制肿瘤细胞过度增殖和转移的关键基因及其机制。胰腺癌的发病率死亡率处于癌症的前十位。胰腺癌确诊后往往病情进展迅速,细胞增殖速度快,死亡率高,是临床预后最差的消化系统恶性肿瘤之一。本部分课题旨于通过全基因组随机基因敲除调控技术平台和CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)增殖追踪方法,筛选抑制肿瘤细胞增殖的关键基因,为临床肿瘤治疗提供新的靶点。黑色素瘤是皮肤肿瘤的主要致死因素,其致死原因主要是黑色瘤的高转移率,病人在确断时往往已有淋巴结或远端器官的转移。细胞融合是肿瘤发生和发展过程中常见的现象之一,在多种肿瘤及其转移瘤中(如乳腺癌,前列腺癌以及黑色素瘤)都可见肿瘤细胞融合及其引起的多倍体现象,并与疾病的预后呈负相关。本部分课题旨于研究黑色素瘤细胞融合后,肿瘤细胞转移的病理特征及转移相关机制。方法：Ⅰ通过构建基因搜寻载体TNO-PB和建立稳定表达tTA并受四环素调控的细胞系。转入搜寻载体TNO-PB质粒和转座酶mPB质粒,筛选获得全基因组范围内的胰腺癌随机基因突变文库。应用CFSE荧光探针追踪胰腺癌细胞增殖和流式分选方法分选增殖减慢细胞亚群。所筛选到的细胞克隆通过CFSE追踪或四甲基偶氯唑盐(MTT)增殖实验验证四环素介导的基因表达调控。Ⅱ通过建立改良植物血凝素-聚乙二醇(phytohemagglutinin-polyethylene glycol, PHA-PEG)细胞融合方法及流式分选方法成功获得了稳定的黑色素瘤融合细胞；流式测定黑色素瘤融合细胞DNA含量；分析黑色素融合细胞的核型及染色体数的变化；体外培养及细胞计数检测融合细胞的增殖速度；小鼠皮下注射检测肿瘤生长和尾静脉注射检测肿瘤细胞转移能力；Affymatrix基因芯片分析差异表达的基因和Western blot测定相关蛋白表达。结果：Ⅰ构建了TNO-PB全基因组搜寻质粒；建立了稳定表达tTA并受DOX调控的胰腺癌细胞株；建立了约74万+DOX条件筛选的胰腺癌全基因组随机突变文库；建立了CFSE追踪肿瘤细胞增殖的方法和流式分选增殖减慢细胞群的方法及克隆法筛选增殖减慢克隆的方法。通过以上方法成功筛选到并通过后期的验证确定其为受DOX调控的增殖减慢克隆,为进一步研究肿瘤增殖减慢关键基因打下了基础。Ⅱ成功得到了单一稳定的黑色素融合细胞。黑色素瘤融合细胞的体积和DNA含量均发生翻倍变化,染色体由多2倍体转变为多4倍体。体外增殖实验显示黑色素瘤融合细胞的体外增殖速度明显减慢,体内生长曲线也显示黑色瘤融合细胞的皮下肿瘤生长速度减慢；但黑色素瘤融合细胞转移能力明显增强。基因芯片分析结果显示黑色素瘤融合细胞与增殖相关的PI3K-AKT通路明显下调。Western分析验证融合细胞中PI3K-AKT通路下游蛋白phospho-S6表达明显降低。提示细胞融合通过PI3K-AKT通路降低黑色素瘤细胞增殖能力。基因芯片显示与黑色素转移相关的β-tubulin2基因表达显著提高(>10倍)。结论：在胰腺癌细胞模型中成功建立了约74万+DOX条件下筛选的胰腺癌全基因组突变文库。建立了CFSE追踪肿瘤细胞增殖方法以及流式法分选增殖减慢细胞群、克隆法筛选增殖减慢克隆方法。成功得到了受DOX调控的胰腺癌增殖减慢克隆。为肿瘤的增殖抑制研究提供了新的研究方法。在黑色素瘤细胞模型中建立了高效的PHA-PEG细胞融合方法；并得到了稳定的黑色素瘤融合细胞,发现其体外细胞增殖和皮下成瘤能力降低,但肺转移能力显著增强。芯片分析结果显示细胞融合可能通过PI3K-AKT通路降低黑色素瘤细胞增殖能力,并通过β-tubulin2基因表达提高黑色素瘤转移能力。本部分课题为进一步研究细胞融合在肿瘤转移中的作用和机制打下了基础。