研究背景急性胃黏膜损伤(Acute gastric mucosal lesions,AGML)指胃黏膜屏障保护作用减弱,胃黏膜发生不同程度的水肿、溃疡、糜烂和出血,是一种常见的临床问题。尽管有很多治疗急性胃黏膜损伤的药物,但是胃黏膜损伤经常容易复发,并且患这种疾病病人的数量一直保持在一个稳定状态。过度、持续性伤害性应激是诱发急性胃黏膜损伤的一个关键性致病因素,胃是应激状态下最为敏感的器官之一。现有研究显示,各种困难复杂的手术、休克、严重感染、脓毒症、多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome or failure,MODS or MODF)和严重烧伤、创伤等都可引起AGML。特别是休克引起的低血流灌注,均能减少胃壁血流,损伤胃黏膜屏障,影响胃黏膜上皮细胞的功能,发生应激性胃黏膜水肿、溃疡甚至糜烂出血。与应激相关的胃黏膜损伤估计影响75%以上的急危重病人,其中3%-4%可发生严重的胃出血,这可使原有疾病加重或恶化,病死率明显升高。在ICU与应激相关的胃出血发生率为0.6%-6%。有研究表明应激性溃疡与胃酸分泌增多的关系不大,更依赖于胃黏膜血流量的减少、缺血缺氧和再灌注损伤。任何影响胃壁血流(Gastric wall blood flow,GWBF)的因素都会对胃黏膜上皮细胞(Gastric mucosal epithelial cells,GMEC)的功能产生影响,削弱胃黏膜保护屏障。胃酸增多显然能加重胃黏膜防御系统的负荷,但是应激性溃疡时胃酸一般不高,甚至减少。尽管如此,仍不能否定H~+在应激性胃溃疡发病中的作用。由于胃黏膜屏障受损,H~+浓度虽然不高,仍可逆行性扩散,出现胃壁内酸化,则可产生急性胃黏膜损害。此外,一些炎性介质的失控和代谢产物也会对胃黏膜的功能产生影响。尽管存在上述一些已经明确影响胃黏膜功能的因素,但是应激诱导急性胃黏膜损伤的病理生理机制仍然还不是很清楚。考虑急性胃黏膜损伤受多因素、多途径调控,因此,迫切需要寻找与急性胃黏膜损伤发病机制相关的新的信号分子和信号传导通路,为防治疗急性胃黏膜损伤提供靶点。目前认为,AGML的发生与神经和体液等诸多因素有关。瞬时受体电位锚蛋白1(Transient receptor potential ankyrin-1,TRPA1)和P物质(Substance P,SP)都丰富表达且共存表达于大鼠的胃组织和支配胃组织相应阶段胸8-胸11(T8-11)背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG),这样二者之间可能存在某种相互作用。Kondo T报道TRPA1参与大鼠内脏痛觉过敏的调节,预先鞘内注射和腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-030031或敲除TRPA1可以有效减轻大鼠胃扩张引起的伤害性刺激。给予P物质神经激肽-1受体拮抗剂SR140333和CP 99994可以分别有效减轻酒精引起的C57/BL6J小鼠胃损伤和SD大鼠浸水束缚应激引起的膀胱损伤。有报道TRPA1和P物质均可引起神经源性炎症和非神经源性炎症。在2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene-sulfonic-acid,TNBS)诱导的小鼠结肠炎模型,TRPA1对P物质的释放具有调控作用,但是二者在急性胃黏膜损伤中的作用尚不明确。研究目的冷水束缚应激(Water immersion restraint stress,WIRS)因为其良好的可重复性和临床相关性,被广泛应用于应激诱导急性胃黏膜损伤的实验模型。因此,本课题采用冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤模型,初步探讨:1.冷水束缚应激对支配大鼠胃组织相应阶段背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中TRPA1和P物质表达的影响,观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的作用并探讨可能的机制。2.大鼠鞘内、腹腔注射TRPA1特异性拮抗剂HC-030031和口服TRPA1特异性激动剂异硫氰酸烯丙酯(Allyl isothiocyanate,AITC),进一步观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的影响并探讨可能的机制,以及TRPA1对P物质释放的影响。研究方法雄性Wistar大鼠(weight 180-220g,6–8weeks old),随机分为6组,空白对照组(Control group),大鼠未经过任何处理;冷水束缚应激模型组(WIRS group),大鼠在自制的鼠笼内冷水(16±1℃)浸泡6h,水位平大鼠剑突;鞘内注射HC-030031组(ITIH group),大鼠冷水束缚应激前30min鞘内注射HC-030031 10μl(10μg/μl,HC-030031溶解在二甲基亚砜);腹腔注射HC-030031组(IPIH group),大鼠冷水束缚应激前1h腹腔注射HC-030031(150 mg/kg,HC-030031溶解在0.5%甲基纤维素)。冷水束缚应激6h后,取大鼠的背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜。AITC组,口服AITC 17mg/kg(AITC溶解在含有3%乙醇和10%吐温的生理盐水中),AITC对照组口服不含有AITC的溶液,2h后,取大鼠的背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜,应用苏木素-伊红染色(Hematoxylin and eosin stain,HE)或戊二醛、四氧化锇酸固定及一系列处理胃组织后,分别应用光学显微镜(Optical Microscope,OM)和透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察各组大鼠胃黏膜和胃黏膜细胞的损伤情况。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)、免疫组织化学(IHC)分别检测背根神经节和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达的变化。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胃黏膜中P物质浓度的变化。实验结果1.光学显微镜观察各组大鼠胃组织HE染色胃黏膜损伤情况显示,未经处理的Control组:胃黏膜结构正常,层次清楚,上皮完整,上皮层细胞排列紧密、规则,未见坏死脱落;间质无水肿及红细胞渗出和炎症细胞浸润;固有层腺体排列整齐、密集,未见萎缩和缺失;黏膜下层也未见肿胀及毛细血管出血倾向和瘀血扩张。WIRS组:胃黏膜片状脱落,多发浅表溃疡,有时可见火山口样巨大溃疡。可见大量急性糜烂性出血性坏死灶;黏膜层广泛的上皮细胞弥漫性凝固坏死脱落,同时伴有广泛的红细胞渗出和炎性细胞浸润,毛细血管出血及瘀血扩张;固有层腺体结构紊乱、萎缩明显,数量减少甚至缺失;细胞间质变大水肿;黏膜下层结构疏松水肿、血管淤血扩张。与Control组比较,WIRS组胃黏膜损伤评分明显提高(P<0.001)。ITIH组或IPIH组:胃黏膜完整性较好,受损黏膜较表浅局限,仅有轻度充血、水肿,偶见炎性细胞浸润;表层上皮有少部分坏死、脱落;局部腺体结构紊乱。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜损伤评分明显降低(P<0.001)。AITC组:可见胃黏膜受损,上皮细胞坏死脱落;黏膜层水肿,可见红细胞渗出和毛细血管出血;偶见黏膜下层结构疏松水肿和血管淤血扩张。与Control比较,AITC组胃黏膜损伤评分明显提高(P<0.001)。2.TEM观察各组大鼠胃黏膜细胞损伤情况显示,未经处理的Control组:胃组织上皮细胞完整;线粒体、粗面内质网和细胞核结构正常。WIRS组:胃组织上皮细胞变性;广泛存在主细胞和/或壁细胞的细胞核受损、核周间隙增宽;线粒体受损严重,有些完全失去正常结构,轮廓模糊、线粒体嵴减少或消失;粗面内质网扩张甚至空泡变性;紧密连接松散;有些分泌小管极度扩张。与Control比较,胃黏膜细胞损伤评分明显提高(P<0.001)。ITIH组或IPIH组:局部可见线粒体损伤,但线粒体嵴和轮廓存在;粗面内质网局部扩张,空泡变性基本消失;紧密连接结构正常;未见分泌小管扩张。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜细胞损伤评分明显降低(P<0.001)。AITC组:可见胃组织的主细胞和/或壁细胞核受损、周间隙增宽;可见线粒体损伤,多伴有线粒体嵴减少或消失,但轮廓存在;粗面内质网局部扩张,偶发空泡变性;偶见分泌小管扩张。与Control组比较,AITC组胃黏膜细胞损伤评分明显提高(P<0.001)。3.同Control组比较,WIRS组大鼠背根神经节(T8-11)和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达上调、胃黏膜中P物质释放增加(P<0.001)。4.同WIRS组比较,鞘内或腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-03003(1ITIH组或IPIH组),有效减轻WIRS诱导的大鼠急性胃黏膜损伤和抑制背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中P物质释放(P<0.001)。5.同Control组比较,口服TRPA1特异性激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤,大鼠背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中P物质的释放明显增加(P<0.001)。结论1.冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤,使背根神经节(T8-11)和胃组织中TRPA1和P物质的表达上调、胃黏膜中P物质的释放增加。应激诱导的急性胃黏膜损伤与TRPA1和P物质的激活密切相关,其机制可能是二者的激活引起神经元性和非神经源性炎症以及内脏痛觉过敏。2.TRPA1拮抗剂HC-030031明显改善冷水束缚应激引起的大鼠急性胃黏膜损伤,其机制可能是HC-030031显著抑制TRPA1的表达和P物质在背根神经节、胃组织和胃黏膜中的释放,减轻其在胃组织引起的神经源性和非神经源性炎症及内脏痛觉过敏。3.TRPA1激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤和P物质在大鼠背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中的释放明显增加。4.在应激诱导的AGML的大鼠模型中,P物质的释放主要由TRPA1调控。