论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种传染病,临床上主要表现为母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状及高死亡率。1987年美国首次发现该病,1996年我国首次分离到PRRSV (CH-1a株)。近二十年来,PRRS在我国多次爆发,尤其是2006年我国出现的高致病性猪蓝耳病病毒株,使该病在我国猪群中持续流行,给防控带来很大挑战,也给养猪业造成重大经济损失。亲环蛋白家族各成员在生物体内广泛存在且高度保守,具有肽脯氨酰顺反异构酶活性,通过催化含脯氨酸的寡肽底物的顺反异构帮助蛋白质正确折叠和组装。目前有超过60种的亲环蛋白家族成员被发现,其中亲环蛋白A (CypA)作为免疫抑制药物环孢素A (CsA)的细胞内作用靶点最早从牛胸腺细胞中被分离出来,是亲环蛋白家族最典型的代表,而且是最早发现且含量最丰富的亲环蛋白家族成员。近年来,关于CypA的研究主要集中在其对病毒感染的作用上,如丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型、甲型流感病毒、轮状病毒等。为探讨CypA在PRRSV感染过程中的作用,我们开展了以下研究：1. PRRSV感染对CypA表达的影响通过Western Blot和间接免疫荧光实验检测PRRSV感染Marc-145细胞后12h、24h、36h和48h CypA在蛋白表达水平和细胞定位的变化,发现PRRSV感染对CypA的表达水平没有影响,但PRRSV感染后的12h、24h和36h可引起CypA在核周形成点状聚集。2.超表达及干扰CypA对PRRSV增殖的影响将构建的表达猴源CypA的真核表达质粒和合成的猴源CypA干扰分子分别转染Marc-145细胞,转染后24h接种PRRSV,通过空斑实验检测超表达及干扰CypA对PRRSV增殖的影响,结果超表达CypA对PRRSV的增殖具有一定的促进作用,干扰CypA则显著抑制PRRSV的增殖。3. CypA抑制剂CsA对PRRSV增殖的影响将CsA以不同浓度分别作用于Marc-145和PAM细胞,通过空斑检测其对PRRSV增殖的影响,结果不同浓度的CsA均能抑制PRRSV的增殖和PRRSV Nsp2蛋白的表达,并且呈剂量依赖性。终浓度为8μmol/L的CsA在PRRSV感染Marc-145和PAM细胞后12h、24h、36h和48h均能显著抑制PPRSV的增殖和PRRSV Nsp2蛋白的表达。4. CypA抑制剂CsA对PRRSV感染诱导的炎症反应的影响PRRSV的感染促进MAPK信号通路中JNK、p38和ERK1/2的磷酸化,通过Western Blot实验检测发现,CsA抑制PRRSV感染Marc-145细胞所诱导的JNK、 p38和ERK1/2的磷酸化。同时,PRRSV的感染能够诱导一系列炎症细胞因子的表达,通过Real-time RT-PCR检测发现,CsA在mRNA水平能够抑制Marc-145细胞中PRRSV感染诱导的IL-6、IL-8和TNF-α的激活。5.与CypA相互作用的PRRSV编码蛋白的确定病毒蛋白与宿主蛋白之间的相互作用是其致病的分子基础之一,本研究从蛋白互作的角度探究了CypA影响PRRSV增殖的可能机制。首先构建了猪源CypA及PRRSV所有编码蛋白的酵母融合表达质粒,通过酵母双杂交实验发现CypA与PRRSV Nsp1β存在相互作用,随后通过间接免疫荧光证实在Marc-145细胞中CypA与Nsp1β共定位,并进一步通过CO-1β证实了二者的相互作用。说明CypA与PRRSV Nsp1β存在相互作用。6.与CypA相互作用的PRRSV Nsplp结构域的确定为了进一步探究与CypA相互作用的Nsp1β的结构域,根据已报道的PRRSV Nsp1β晶体结构,构建了Nsp1β不同截短突变体的酵母及真核表达质粒,通过酵母双杂交及CO-IP实验发现与CypA相互作用的Nsp1β的结构域均分别为Nsp1β(1aa-181aa)、Nsp1β(49aa-181aa)和Nsp1β (49aa-203aa),初步推测与CypA相互作用的最小结构域为PRRSVNsp1β (49aa-181aa)。7. PRRSV Nsp1β、CypA及其抑制剂CsA对IFN-β启动子活性的影响已有研究表明PRRSV Nsp1β抑制SeV诱导的IFN-β启动子的活性,本研究通过荧光素酶报告系统发现,CypA能抑制SeV对IFN-β启动子活性的激活,并且呈剂量依赖性；CsA促进SeV对IFN-β启动子活性的激活,并且呈剂量依赖性；PRRSV Nsp1β抑制SeV对IFN-β启动子活性的激活,但Nsp1β (182aa-203aa)能够完全消除此抑制作用。初步推测Nsp1β (1aa-181aa)是其抑制IFN-β所必需的。