玉米是世界第一大粮食作物,也是饲料和工业加工原料的主要来源。随着经济水平的发展和人口数量的增加,人们对玉米品质和产量的要求越来越高。种子发育是决定产量和品质的关键环节,鉴定和研究调控玉米种子发育的关键基因,解析玉米种子发育的分子机制,具有非常重要的理论意义和应用价值。PPR（Pentatricopeptide repeat）基因是2000年发现的一个大的基因家族,成员广泛存在于真核生物中,在陆生植物中尤为普遍。PPR蛋白是由多个PPR基序为单位串联而成的一类序列特异性RNA结合蛋白,常定位于线粒体或质体,通过与特定RNA序列结合参与RNA编辑、剪接、稳定、翻译等转录后加工过程,直接调控线粒体或质体基因表达,进而调控线粒体或质体的生物发生及功能。PPR蛋白功能缺失通常会导致植物种子发育异常、花粉败育等,因此倍受研究者关注。我们从UniformMu玉米突变体库分离获得了 emp17和emp18突变体,通过种子表型观察、Mu转座子插入鉴定、等位突变体杂交等确定两个PPR基因的突变是导致emp17和emp18种子败育的分子原因,通过蛋白亚细胞定位、线粒体基因转录本分析查明了Emp17、Emp18参与种子发育的分子功能,通过线粒体呼吸链复合物组装及活性检测等验证了Emp17和Emp18的功能,并由此解析了Emp17、Emp18影响玉米种子发育的分子基础。上述研究得出以下主要结论:1)Emp17、Emp18突变导致玉米种子败育emp17、emp18杂合体自交后代种子呈现分离比1:3的emp（empty pericarp）突变体和野生型,表明两者都是单基因隐性突变。突变种子主要表现为白化、皱缩、粒小和半透明,成熟时,种皮严重塌陷、中空,种子败育。不同发育阶段的石蜡切片观察显示,emp17、emp18突变体种子胚发育被停滞在转变期,未见盾片、芽顶端分生组织、根顶端分生组织等分化结构产生,同时,胚乳发育也严重受阻,在种皮和胚乳间留下一个空隙。2)Emp1 7、Emp18编码线粒体定位的E和DYW类PPR蛋白cDNA和gDNA序列比对显示Emp17基因全长1947 bp,编码一个由648个氨基酸组成的蛋白EMP17,网站预测该蛋白属于PLS亚家族的E类PPR蛋白,包含14个PPR基序和一个E结构域。GFP融合蛋白在烟草叶下表皮细胞的瞬时表达证实EMP17定位在线粒体。cDNA和gDNA序列比对显示Emp18基因全长2421 bp,编码一个由806个氨基酸组成的蛋白EMP18,网站预测该蛋白包含17个PPR基序、1个E结构域、1个E+结构域和1个DYW结构域,属于PLS亚家族的DYW类PPR蛋白。GFP融合蛋白在烟草叶下表皮细胞和拟南芥原生质体的瞬时表达显示EMP18是一个线粒体定位的蛋白。3)Emp17参与线粒体nad1第4个内含子和nad4第1个内含子的剪接通过分析野生型和emp17-1突变体籽粒线粒体编码基因的RNA转录水平,发现与野生型相比,emp17-1突变体nad1、nad4成熟转录本明显减少或消失。Ⅱ类内含子的RT-PCR和qRT-PCR扩增结果显示,nad4第1个内含子在野生型中100%剪接,而emp17-1突变体中几乎不发生剪接,emp17-1突变体nad1第4个内含子的剪接效率较野生型明显下降,而线粒体其他20个Ⅱ类内含子的剪接效率在野生型和突变体间基本一致,说明Emp17特异性地参与线粒体nad1第4个内含子和nad4第1个内含子的剪接,它的突变导致这两个内含子剪接缺陷或缺失。4)EMP17功能缺失导致线粒体呼吸链复合物Ⅰ组装受阻、活性丧失Nad1和Nad4是线粒体呼吸链复合物Ⅰ的重要蛋白亚基。通过野生型和emp1 7-1籽粒线粒体蛋白的BN-PAGE、考马斯亮蓝染色和NADH脱氢酶活性染色分析,发现emp1 7-1线粒体复合物Ⅰ特异条带显著减弱,且几乎检测不到NADH脱氢酶活性。认为EMP17功能丧失造成线粒体nad1、nad4内含子剪接缺陷,Nad1和Nad4蛋白异常,影响线粒体呼吸链复合物Ⅰ的正常组装,进而导致NADH脱氢酶活性丧失。5)Emp18参与线粒体atp6-35和cox2-449位点C到U编辑野生型和emp18突变体籽粒线粒体编码基因转录本编辑分析发现,atp6-635位点C到U编辑在Emp18两个等位突变体emp18-1、emp18-2中完全缺失,cox2-449位点在野生型中完成100%编辑,但在两个等位突变体中该位点的编辑发生不同程度缺陷,emp18-1突变体中编辑完全缺失,而emp18-2突变体中仍可进行约50%编辑。这两个位点的编辑缺失分别导致Atp6第212位亮氨酸（Leu）转变为脯氨酸（Pro）,Cox2第150位蛋氨酸（Met）转变为苏氨酸（Thr）。6)EMP18功能缺失导致线粒体F1Fo-ATPase全酶组装受阻F1Fo-ATPase全酶由催化ATP合成的F1亚复合物和参与质子传递的Fo亚复合物组成。线粒体Fo亚复合物主要由一个a亚单位,一个b亚单位和一个由多个c亚单位构成的c环组成,a亚单位由线粒体基因atp6编码。野生型和emp18突变体a亚单位蛋白的空间结构预测显示,第212位Pro的替换致使第2个α螺旋结构被破环,a亚单位构象发生改变,说明atp6-635位点C到U编辑对a亚单位正确构象的维持十分重要。进一步的Western blot和ATP水解活性分析表明,emp18突变体F1Fo-ATPase全酶组装效率明显降低,游离F1亚复合物增加6-7倍,emp18突变体F1Fo-ATPase全酶ATP水解活性减弱,游离F1亚复合物活性增加。推测,EMP18突变造成atp6-635位点编辑缺失,氨基酸替换,蛋白构象改变,进而导致F1Fo-ATPase全酶组装受阻、活性减弱。7)emp17、emp18突变体交替呼吸途径激活线粒体呼吸以细胞色素途径为主,但当细胞色素呼吸途径受阻时,交替呼吸途径可被诱导激活。交替呼吸途径Marker基因AOX1、AOX2和AOX3表达水平的RT-PCR、qRT-PCR和Western blot分析显示,与野生型相比,emp17和emp18突变体AOX2的转录和蛋白水平明显上调,结合线粒体呼吸速率测定结果,暗示emp17和emp18突变体细胞色素呼吸途径受阻,交替呼吸途径被诱导激活。综合上述研究结果,认为玉米PPR基因Emp17通过参与线粒体nad1第4个内含子、nad4第1个内含子剪接,Emp18通过参与线粒体atp6-635、cox2-449位点编辑,分别影响线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅴ的组装和活性,进而影响线粒体生物学功能,最终导致玉米种子胚和胚乳发育严重受阻,胚胎致死、种子败育,表明Emp17和Emp18对线粒体RNA转录后加工,线粒体生物学功能以及玉米种子发育是必需的。