论文部分内容阅读
目的：
1.探讨在低氧高二氧化碳环境下，PI3K/AKT/mTOR信号轴在大鼠肺动脉平滑肌细胞自噬中的作用。
2.探讨在低氧高二氧化碳环境下，三七总皂苷对大鼠肺动脉平滑肌细胞自噬的干预效应及机制。
方法：
（一）机制
将大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）作为研究对象，完全培养基培养后换用无血清的DMEM高糖培养基饥饿24h，随机分为五组：对照组（N），低氧高二氧化碳组（H），溶剂DMSO组（D），PI3K抑制剂LY294002组（L），激动剂IGF-1组（I）。N组依旧置于常氧细胞培养箱（21%O2，5%CO2）中培养24h，其余四组置于造模培养箱（5%O2，6%CO2），加入各组对应的干预因素培养24h。CCK-8法测各组的细胞活力；用实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测自噬相关基因AKT、mTOR、LC3、P62；用蛋白免疫印迹法（WB）检测自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、LC3B、P62及增殖蛋白PCNA的表达水平；采用透射电镜检测细胞内部超微结构的改变，如自噬小体。
（二）加药
将大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）作为研究对象，预处理同上。随机分为五组：对照组（N），低氧高二氧化碳组（H），三七总皂苷组（H3），PI3K抑制剂LY294002组（L），抑制剂LY294002加三七总皂苷组（L3）。N组置于常氧细胞培养箱（21%O2，5%CO2）培养24h，其余四组置于造模培养箱（5%O2，6%CO2），加入各组对应的药物培养24h。所有检测方法及指标同方法一。
结果：
（一）机制：①与N组比，H组PASMCs活力减弱；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62下调，LC3上调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62下调，LC3B上调；电镜下观察到自噬小体数量增多；增殖蛋白PCNA表达上调。提示低氧高二氧化碳引起大鼠PASMCs自噬增强，增殖增多。②与H组比，D组各项指标均无差异。L组PASMCs细胞活力减弱；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62下调，LC3上调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62下调，LC3B上调；电镜下观察到自噬小体数量增多；增殖蛋白PCNA表达上调。说明LY294002可以促进低氧高二氧化碳环境下大鼠PASMCs自噬增强，增殖增多。③与H组比，I组PASMCs活力增强；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62上调，LC3无差异；在蛋白表达水平上p-AKT、p-mTOR、P62上调，LC3B无差异，电镜下观察到自噬小体数量减少；增殖蛋白PCNA表达无明显差异；以上结果表明IGF-1可以逆转低氧高二氧化碳环境下大鼠PASMCs的自噬增多。④由以上结果可初步推断，PI3K/AKT/mTOR信号轴可能参与低氧高二氧化碳环境下大鼠PASMCs的自噬增强。
（二）加药：①与N组比，H组PASMCs活力减弱；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62下调，LC3上调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62下调，LC3B上调；电镜下观察到自噬小体数量增多；增殖蛋白PCNA表达上调。②与H组比，H3组PASMCs活力无明显差异；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62上调，LC3下调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62上调，LC3B下调，电镜下观察到自噬小体数量减少；增殖蛋白PCNA表达下调。提示PNS有助于减弱低氧高二氧化碳环境下大鼠PASMCs自噬，并使其增殖减少。③与H组比，L组PASMCs活力减弱；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62下调，LC3上调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62下调，LC3B上调；电镜下观察到自噬小体数量增多；增殖蛋白PCNA表达上调。④与L组比，L3组PASMCs活力无明显差异；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62上调，LC3下调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62上调，LC3B下调；电镜下观察到自噬小体数量减少；增殖蛋白PCNA表达下调。表明在PNS可以缓解LY294002处理的大鼠PASMCs自噬及增殖增多，其机制可能与激活PI3K/AKT/mTOR信号轴有关。
结论：
1.在低氧高二氧化碳环境下，大鼠肺动脉平滑肌细胞自噬增强，可能与PI3K/AKT/mTOR信号轴抑制有关。
2.在低氧高二氧化碳环境下，三七总皂苷可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号轴抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞自噬。
1.探讨在低氧高二氧化碳环境下，PI3K/AKT/mTOR信号轴在大鼠肺动脉平滑肌细胞自噬中的作用。
2.探讨在低氧高二氧化碳环境下，三七总皂苷对大鼠肺动脉平滑肌细胞自噬的干预效应及机制。
方法：
（一）机制
将大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）作为研究对象，完全培养基培养后换用无血清的DMEM高糖培养基饥饿24h，随机分为五组：对照组（N），低氧高二氧化碳组（H），溶剂DMSO组（D），PI3K抑制剂LY294002组（L），激动剂IGF-1组（I）。N组依旧置于常氧细胞培养箱（21%O2，5%CO2）中培养24h，其余四组置于造模培养箱（5%O2，6%CO2），加入各组对应的干预因素培养24h。CCK-8法测各组的细胞活力；用实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测自噬相关基因AKT、mTOR、LC3、P62；用蛋白免疫印迹法（WB）检测自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、LC3B、P62及增殖蛋白PCNA的表达水平；采用透射电镜检测细胞内部超微结构的改变，如自噬小体。
（二）加药
将大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）作为研究对象，预处理同上。随机分为五组：对照组（N），低氧高二氧化碳组（H），三七总皂苷组（H3），PI3K抑制剂LY294002组（L），抑制剂LY294002加三七总皂苷组（L3）。N组置于常氧细胞培养箱（21%O2，5%CO2）培养24h，其余四组置于造模培养箱（5%O2，6%CO2），加入各组对应的药物培养24h。所有检测方法及指标同方法一。
结果：
（一）机制：①与N组比，H组PASMCs活力减弱；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62下调，LC3上调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62下调，LC3B上调；电镜下观察到自噬小体数量增多；增殖蛋白PCNA表达上调。提示低氧高二氧化碳引起大鼠PASMCs自噬增强，增殖增多。②与H组比，D组各项指标均无差异。L组PASMCs细胞活力减弱；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62下调，LC3上调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62下调，LC3B上调；电镜下观察到自噬小体数量增多；增殖蛋白PCNA表达上调。说明LY294002可以促进低氧高二氧化碳环境下大鼠PASMCs自噬增强，增殖增多。③与H组比，I组PASMCs活力增强；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62上调，LC3无差异；在蛋白表达水平上p-AKT、p-mTOR、P62上调，LC3B无差异，电镜下观察到自噬小体数量减少；增殖蛋白PCNA表达无明显差异；以上结果表明IGF-1可以逆转低氧高二氧化碳环境下大鼠PASMCs的自噬增多。④由以上结果可初步推断，PI3K/AKT/mTOR信号轴可能参与低氧高二氧化碳环境下大鼠PASMCs的自噬增强。
（二）加药：①与N组比，H组PASMCs活力减弱；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62下调，LC3上调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62下调，LC3B上调；电镜下观察到自噬小体数量增多；增殖蛋白PCNA表达上调。②与H组比，H3组PASMCs活力无明显差异；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62上调，LC3下调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62上调，LC3B下调，电镜下观察到自噬小体数量减少；增殖蛋白PCNA表达下调。提示PNS有助于减弱低氧高二氧化碳环境下大鼠PASMCs自噬，并使其增殖减少。③与H组比，L组PASMCs活力减弱；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62下调，LC3上调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62下调，LC3B上调；电镜下观察到自噬小体数量增多；增殖蛋白PCNA表达上调。④与L组比，L3组PASMCs活力无明显差异；在基因表达水平上自噬相关基因AKT、mTOR、P62上调，LC3下调；在蛋白表达水平上自噬相关蛋白p-AKT、p-mTOR、P62上调，LC3B下调；电镜下观察到自噬小体数量减少；增殖蛋白PCNA表达下调。表明在PNS可以缓解LY294002处理的大鼠PASMCs自噬及增殖增多，其机制可能与激活PI3K/AKT/mTOR信号轴有关。
结论：
1.在低氧高二氧化碳环境下，大鼠肺动脉平滑肌细胞自噬增强，可能与PI3K/AKT/mTOR信号轴抑制有关。
2.在低氧高二氧化碳环境下，三七总皂苷可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号轴抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞自噬。