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背景与目的:炎症的本质即为机体免疫系统对外来异物或自身破碎组织细胞进行清除的过程。适度的炎症反应对机体具有保护作用,但当机体遭受过度或失控性的炎症反应时,则可引起宿主自身组织结构和生理功能的广泛损害,导致系统性炎症反应综合症(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)的发生,最终引起脓毒症及多器官功能障碍综合症(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS),甚至死亡。过度炎症性反应主要是细胞分泌的炎症介质之间相互作用导致炎症信号“瀑布式”放大的效应。大量细胞因子释放入血,TNF-α、ROS、NO及COX-2的产生等将引起SIRS,过度SIRS造成远离组织器官的损伤,继发MODS、脓毒血症。而近几年应用的针对单一炎症介质抑制或拮抗的措施并不能较好地阻断炎症信号“网络”介导的整个炎症反应演进过程。NF-κB是一种核转录因子,现被认为在炎症性疾病的发病中起关键性调节作用。在正常细胞内,NF-κB和它的抑制性蛋白I-κBα相结合,以非活性的形式存在于胞浆中。当细胞受到细菌、病毒、LPS、TNF-α等外源性刺激后,I-κBα即发生磷酸化,进而泛素化,泛素化后的I-κBα即可被26S proteasome识别并降解;至此,活化的NF-κB便移位到细胞核中,结合到靶基因的转录起始区域,激活细胞因子、粘附分子和COX-2等的表达。26S proteasome是细胞内最主要的非溶酶体蛋白酶复合物,其通过细胞周期时限特异性的生物学机制精确的调控细胞内70-90%的蛋白降解,NF-κB的抑制因子I-κBα及许多与细胞周期循环和凋亡相关的重要因子、转录因子等多经泛素-蛋白酶体途径(UPS)降解。左旋紫草素是中药紫草的主要活性成分,据文献报道,其具有抗炎、抗肿瘤等作用。本研究组运用建立的蛋白酶体抑制剂筛选平台,证明左旋紫草素可能是一种新的蛋白酶体抑制剂,其抗肿瘤作用与蛋白酶体功能抑制有关。但对其抗炎及其他作用与蛋白酶体抑制效应的关系尚未明确。本实验通过观察左旋紫草素的抗炎作用与其蛋白酶体活性抑制效应之间的关系,探讨其抗炎作用与抑制蛋白酶体活性的机制;同时复制了三种动物模型探讨其对急性炎症抗炎和脓毒症小鼠存活率的影响,为左旋紫草素用于炎症相关性疾病的防治提供实验依据。方法1.无菌收集培养SD大鼠腹腔巨噬细胞,分别加入左旋紫草素预处理及脂多糖(LPS,1μg/ml)刺激。实验组予以不同浓度左旋紫草素预处理加LPS刺激、阳性对照组予以脂多糖刺激。2.应用ELISA方法检测各组细胞培养上清液中炎症介质TNF-α的含量,观察左旋紫草素的抗炎效应。3.应用细胞免疫荧光方法检测转录因子NF-κB各组细胞内核转位情况,观察左旋紫草素对各组细胞NF-κB活性的抑制效应。4.应用Western blot方法检测左旋紫草素对各组腹腔巨噬细胞泛素化蛋白(Ub-prs)和NF-κB抑制蛋白I-κBα的表达水平,观察转录因子NF-κB活性抑制与蛋白酶体活性抑制的关系。5.应用流式细胞仪,AnnexinV和PI双染法检测分析由左旋紫草素诱导的小鼠巨噬细胞系Ana/1细胞凋亡情况。6.分别采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的方法,探讨左旋紫草素对急性炎症的抗炎作用。7.复制由LPS(35mg/kg)诱导的小鼠脓毒症模型,观察左旋紫草素对小鼠脓毒症存活率的影响。结果1.左旋紫草素抑制巨噬细胞释放炎症介质TNF-α,且呈浓度依赖。结果显示,正常大鼠腹腔巨噬细胞在体外RPMI1640培养基中表达少量的细胞因子TNF-α;LPS刺激后,TNF-α表达较空白对照组明显增加(P<0.05);用左旋紫草素预处理后,其细胞培养上清液中TNF-α的分泌量与阳性组相比明显下降(P<0.05),且呈浓度依赖,并于4h时抑制效果更明显。2.左旋紫草素抑制转录因子NF-κB核转位,且呈浓度依赖。结果显示,LPS阳性对照组细胞核内NF-κBp65的表达明显增强;左旋紫草素预处理的腹腔巨噬细胞,NF-κBp65的核内表达与LPS组相比有明显的下降,且表达量与药物浓度负相关。3.左旋紫草素对腹腔巨噬细胞Ub-prs和I-κBα蛋白表达水平的影响。结果表明,反映UPS系统功能的内源性蛋白Ub-prs、I-κBα的表达量在LPS阳性组有明显的下降,而左旋紫草素处理组与阳性组相比有明显的升高,且有剂量依赖关系。4.左旋紫草素诱导小鼠巨噬细胞系Ana/1细胞凋亡,且呈浓度依赖。结果显示,左旋紫草素对Ana/1细胞在低剂量时即有促凋亡作用,在剂量4μmol/L时凋亡率达到66.5%。5.左旋紫草素抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀及减轻醋酸所致小鼠腹腔毛细血管的通透性。结果显示,左旋紫草素各剂量组均能明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀程度及减轻醋酸所致小鼠腹腔毛细血管的通透性(P<0.05),且呈剂量依赖性。6.左旋紫草素增加了由LPS诱导的小鼠脓毒症的存活率。结果显示,各左旋紫草素处理组均能明显增加由LPS诱导的小鼠脓毒症存活率(P<0.05),且以2mg/kg剂量组效果最好。结论1.左旋紫草素能够下调由LPS刺激活化的腹腔巨噬细胞中炎症因子TNF-α的表达释放。2.左旋紫草素对LPS激活的巨噬细胞蛋白酶体活性具有抑制作用。3.左旋紫草素能抑制LPS激活的巨噬细胞NF-κB途径的活化。4.左旋紫草素对炎症动物模型有抗炎作用。