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目的:通过重症急性胰腺炎大鼠模型及人脐静脉内皮细胞损伤模型,探讨紧密连接相关蛋白claudin5、occludin、ZO-1、JAM-C在毛细血管内皮损害中的作用,并从内皮细胞紧密连接角度研究大承气汤改善重症急性胰腺炎毛细血管通透性的机制。 方法:体外实验:使用随机数字法将人脐静脉内皮细胞分为5组:空白对照组、SAP组、大承气汤高、中、低剂量组(分别用含大承气汤100 ug/ml、50 ug/ml、25 ug/mlSAP血清培养),孵育6h、12h、24 h,分别采用TER法、FITC-Dextran法检测单层内皮细胞通透性;采用免疫荧光化学方法及Western blot法检测内皮细胞紧密连接相关蛋白claudin5、occludin、ZO-1、JAM-C蛋白的定位表达;采用荧光定量PCR方法检测内皮细胞中的claudin5、occludin、ZO-1、JAM-C mRNA的表达情况。 体内实验:SD大鼠随机分为假手术组、SAP组(5%牛磺胆酸钠胆胰管逆行注射)和大承气汤组(大承气汤灌胃88.56 mg/天);造模后12h处死各组大鼠,处死前1h经阴茎静脉注入2% EB(Evans Blue),取血清、胰腺、肺、小肠组织。ELISA法检测血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6的含量;运用HE染色法在光镜下观察组织病理变化,Schmidt法对胰腺病理改变进行评分;组织毛细血管通透性采用EB血管外渗法检测;采用免疫荧光化学方法及Western blot法检测组织中的claudin5、occludin、ZO-1、JAM-C蛋白的定位与表达;采用荧光定量PCR方法检测组织中的claudin5、occludin、ZO-1、JAM-C mRNA表达。 结果: 体外实验:(1)人脐静脉内皮细胞通透性结果显示:和Control组比较,SAP组、大承气汤高中低剂量组各时间点内皮细胞通透性均较Control组升高;和SAP组比较,大承气汤高、中剂量组6h、低剂量组12h通透性低于SAP组,且孵育时间延长,通透性越低。(2)免疫荧光化学及Western Blot结果显示:和Control组比较,SAP组、大承气汤高中低剂量组claudin-5、occludin、ZO-1蛋白从6h起均较Control组降低,而JAM-C蛋白则较Control组高;与SAP组比较,大承气汤高剂量组6h起,中低剂量组12h起claudin-5、occludin、ZO-1蛋白较SAP组升高,JAM-C蛋白降低,随着孵育时间延长,程度越显著。(3) RT-RCR结果显示:和Control组比较,SAP组、大承气汤高中低剂量组claudin-5、occludin、ZO-1 mRNA表达6h起均较Control组下降,JAM-CmRNA则较Control组上调;和SAP组比较,大承气汤高剂量组6h起,中低剂量组12h起claudin-5、occludin、ZO-1 mRNA表达较SAP组升高,JAM-C mRNA降低,且随着孵育时间延长,程度越显著。 体内实验:(1) SAP组血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平均高于Control组,大承气汤组与Control组无显著差异。(2)病理观察显示,SAP组、大承气汤组胰腺、肺、小肠组织均有损伤,大承气汤组较SAP组病变轻。(3) SAP组、大承气汤组大鼠的胰腺、肺、小肠组织的毛细血管通透性显著高于Control组,但大承气汤组的毛细血管通透性明显低于SAP组。(4)免疫荧光化学及Western Blot结果显示:SAP组、大承气汤组胰腺、肺、小肠组织claudin-5、occludin、ZO-1蛋白表达低于Control组,JAM-C表达高于Control组,其中SAP组蛋白表达变化程度最高。(5) RT-PCR检测结果显示:SAP组、大承气汤大鼠claudin-5、occludin、ZO-1 mRNA的表达显著低于正常组,JAM-C mRNA的表达显著升高,其中大承气汤组蛋白表达变化程度低于SAP组。 结论: (1)重症急性胰腺炎模型中,毛细血管通透性升高的机制可能与紧密连接相关蛋白claudin5、occludin、ZO-1的下调,JAM-C蛋白的上调有关。 (2)应用大承气汤早期即能改善模型毛细血管通透性,且疗效呈一定的剂量-时间依赖性。 (3)大承气汤降低SAP血管通透性的机制可能与通过调节内皮细胞紧密连接相关蛋白的表达有关。