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背景我们课题组在前期实验中比较了结肠癌细胞株(SW1116)和结肠癌干细胞株(SW1116csc) miRNA表达谱的差异,其中miR-93的表达具有显著差异,miR-93能抑制SW1116csc细胞增殖和集落形成,进一步研究发现miR-93的过度表达抑制HDAC8和TLE4在mRNA和蛋白质水平的表达。为探索miR-93的上游调节分子及其作用机制,我们在SW1116csc细胞内筛选出一条含有miR-93互补序列的lncRNA,作为下一步实验的研究对象,并将其命名为LOCCS (lncRNA overexpressed in colon cancer stem cells)。材料与方法结肠癌干细胞株(SW1116csc)是课题组前期从结肠癌细胞株(SW1116)中分离而来并进行传代培养。我们首先根据LOCCS的序列设计并合成siRNA,构建和转导pENTR/U6-siLOCCS质粒,定量PCR法检测pENTR/U6-siLOCCS转导SW1116csc细胞后miR-93表达水平的改变;其次合成miR-93序列,构建和转导pGL3M-miR-93荧光素酶报告载体,应用双荧光素酶报告分析系统检测内源性LOCCS分子对pGL3M-miR-93的抑制作用;然后采用全基因合成方法合成LOCCS序列,构建和转导pcDNA-LOCCS质粒,同时使用点突变试剂盒构建pcDNA-LOCCS-T质粒后进行转导,应用双荧光素酶报告分析系统检测外源性LOCCS分子对pGL3M-miR-93的抑制作用;最后,在上调或下调LOCCS的过程中,采用定量PCR法和Western blot法检测HDAC8、TLE4、D133、CD29、Stratifin和Musashi-1表达水平的变化,同时检测SW1116csc细胞生长曲线和集落形成率的改变。结果pENTR/U6-siLOCCS质粒经测序鉴定能成功表达siRNA,定量PCR法检测pENTR/U6-siLOCCS转导后的SW1116csc细胞,其miR-93表达水平明显升高。pGL3M-miR-93质粒经测序鉴定能成功表达miR-93,应用双荧光素酶报告分析系统检测发现内源性LOCCS分子对pGL3M-miR-93具有明显抑制作用。pcDNA-LOCCS质粒经测序鉴定能成功表达LOCCS并且含miR-93互补序列,同时pcDNA-LOCCS-T质粒经测序鉴定发现与miR-93互补序列上的碱基有明显改变,应用双荧光素酶报告分析系统检测发现外源性LOCCS分子对pGL3M-miR-93具有明显抑制作用。在mRNA水平上,HDAC8和TLE4在LOCCS-ox组的表达水平较control组明显升高,而在LOCCS-si组的表达水平较control组明显降低;CD133、CD2、Stratifin和Musashi-1在LOCCS-ox组和LOCCS-si组的表达水平较control组明显降低,而在LOCCS-ox组的降低更为明显。但是,HDAC8、TLE4、CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1在蛋白质水平的表达与在mRNA水平的表达不完全一致。同时,我们观察到细胞内的LOCCS水平与细胞增殖和集落形成率呈正相关。结论我们的实验证实了LOCCS在SW1116csc细胞内具有"miRNA海绵”作用,能够吸附miR-93,降低miR-93的表达水平,在miR-93的上游对其起到调控作用。LOCCS促进细胞增殖和集落形成,与miR-93的作用正好相反。LOCCS对HDAC8和TLE4的影响在mRNA水平与miR-93相似,但在蛋白质水平却不完全一致;同时,LOCCS对CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1的影响在mRNA水平和蛋白质水平也不完全一致,提示细胞内蛋白质表达调控的复杂性,并且可能存在其他信号通路涉及其转录和翻译的调控。