脂肪是水产动物饲料的主要能源物质之一,脂肪分解利用的第一个关键步骤是占脂肪主要成分的甘油三酯的水解,生成甘油和脂肪酸。本研究利用分子生物学手段,在中华绒螯蟹中克隆得到了三种甘油三酯水解酶(es_TGL1,es_TGL2和es_IL),并分析了这三种甘油三酯水解酶在中华绒螯蟹各组织中的和饥饿情况下的基因表达模式。采取营养干预手段,全面的分析了中华绒螯蟹幼蟹饲料中新型的饲料添加剂——硫辛酸的最适添加量以及其代谢组学信息后,在不同脂肪含量和不同脂肪源的饲料中添加适量的硫辛酸,探究了中华绒螯蟹幼蟹在生长、体成分、抗氧化能力、甘油三酯分解和脂肪酸组成等方面的响应。通过新兴的脂质组学手段,分析了摄入四种具有代表性的脂肪源后,中华绒螯蟹肝胰腺不同类型脂质的组装和分配。研究结果不仅丰富了中华绒螯蟹甘油三酯水解以及脂肪酸在不同脂质中的分配等相关知识,也为中华绒螯蟹配合饲料的优化和水产动物饲料脂肪的高效利用提供了参考。1.中华绒螯蟹甘油三酯分解关键基因的鉴定与分析脂肪作为水产动物饲料中的三大能源物质之一,能够为机体的生长提供能量以及结构性物质等,机体对脂肪的利用的第一步便是对占主要成分的甘油三酯的动用,而机体对甘油三酯的动用包括对饲料中甘油三酯的水解和对机体储存的甘油三酯的水解两个方面。因此,我们在中华绒螯蟹体内鉴定到了三种甘油三酯水解酶,分别命名为es_TGL1,es_TGL2和es_IL,通过保守区域的分析比对,es_TGL1和es_TGL2属于消化腺分泌的甘油三酯水解酶,负责食物中摄入的甘油三酯的水解利用,es_IL具有PLAT结构域,属于细胞内的甘油三酯水解酶,负责水解体内储存的甘油三酯。es_TGL1全长是2129 bp,包括82 bp的5’端和268 bp的3’端非编码区,其中1797 bp的开放阅读框,编码599个氨基酸;es_TGL2全长1423 bp,包括51 bp的5’端和103 bp的3’端非编码区,1266 bp的开放阅读框编码422个氨基酸;es_IL全长为1939 bp,包括132 bp的5’端和193 bp的3’端非编码区,其中1611 bp的开放阅读框编码537个氨基酸。三个甘油三酯水解酶均属于分泌型蛋白,具有信号肽结构。NCBI的登录号分别为MF182403,MF182404和MF182405。三个基因的组织分布结果表明,es_TGL1在鳃、胃、肝胰腺中具有较高的基因表达量,在围心腔中表达量最低;es_TGL2在肌肉中的表达量最高,在肝胰腺和胃中次之,在围心腔、眼柄和肠道中的表达量非常低;es_IL在肝胰腺中的表达量最高,在肌肉和胃中次之,而在其他四种组织中的表达量都非常低,在组织中的不同表达模式说明这三种甘油三酯水解酶具有不同的组织特异性。经过高脂饲料饲喂4周后的饥饿处理结果显示,血清中的TG在饥饿两周时有显著的上升,血清甘油含量也在饥饿72小时和两周时显著升高,血清中游离脂肪酸随着饥饿时间的延长,先上升后下降;肝胰腺中TG含量随着饥饿时间的延长而逐渐减少,而甘油含量在48小时内呈波动变化,72小时后恢复至饥饿0小时的水平,肝胰腺中游离脂肪酸的含量在各个时间点之间无显著的差异。es_TGL1的表达量在饥饿6小时和12小时呈现显著的上升,表达量在饥饿24小时过后逐渐降低;es_TGL2的表达量在饥饿6,12和24小时有显著的上升,饥饿超过48小时后,也呈现显著降低的趋势;es_IL在6,12和72小时的基因表达量均显著高于对照组,饥饿超过96小时后,开始显著的降低。综上,中华绒螯蟹中鉴定到的三种甘油三酯水解酶,不同的组织特异性,提示研究甲壳动物脂肪的代谢,除了把肝胰腺作为重点外,胃和肌肉也是不容忽视的两种关键组织;随着饥饿时间的延长,消化腺甘油三酯水解酶的表达逐渐降低,并伴随着机体储脂阶段性的被动员用于机体的供能。2.中华绒螯蟹饲料中硫辛酸最适添加量及其代谢机制研究硫辛酸作为一种新型的饲料添加剂,是机体三羧酸循环中的重要辅酶,参与机体的能量代谢,因其口服效果较好,在医药和畜牧领域受到广泛的关注,近些年,硫辛酸在水产动物中的研究也逐渐受到人们的关注。本部分内容探究了中华绒螯蟹幼蟹饲料中硫辛酸的最适添加量以及硫辛酸发挥作用的代谢组学机制。以0,300,600,1200,2400,4800和9600 mg/kg的饲料硫辛酸添加饲喂中华绒螯蟹幼蟹,经过8周的养殖实验,通过折线回归方程,分别以增重率和特定生长率为标准,得到中华绒螯蟹幼蟹饲料中硫辛酸的最适添加量分别为1339.13和1574.09 mg/kg。各个处理组之间蟹体成分均无显著差异。SOD和GSH-Px的活力均随着硫辛酸添加剂量的增加呈现先升高再降低的趋势,在600 mg/kg的添加量中达到最高值;T-AOC同样随着硫辛酸添加量的增加而升高,在4800 mg/kg组最高;4800和9600 mg/kg的硫辛酸处理组的MDA含量显著高于其他剂量添加组;GSH的含量在各个处理组之间无显著的差异。肝胰腺总脂含量在300,600和1200 mg/kg硫辛酸添加组略高于其他处理组,但是在处理组之间无显著的差异,而肝胰腺中甘油三酯的含量随着硫辛酸添加剂量的增加而升高。甘油三酯分解相关基因的表达受饲料硫辛酸添加量的显著影响,其中,es_TGL1,es_TGL2和es_IL在硫辛酸2400 mg/kg添加剂量组具有最高的基因表达量,且es_TGL1在2400 mg/kg硫辛酸添加剂量内,其表达量随着硫辛酸添加的增多而升高;es_DGL的基因表达量在硫辛酸添加剂量为1200 mg/kg组时具有最高值,但是与300和2400 mg/kg添加量组之间无显著的差异;在300 mg/kg硫辛酸添加组,CPT-1具有显著高于其他添加剂量处理组的mRNA表达量。将0和2400 mg/kg硫辛酸处理组中华绒螯蟹血清的代谢组学结果进行比对分析,共得到45个显著差异的代谢物,硫辛酸添加组与对照组相比,有22个代谢物显著增多,23个代谢物显著减少,这些差异代谢物参与到的代谢通路主要涉及脂肪酸代谢(亚麻酸、花生四烯酸),氨基酸代谢(丙氨酸、组氨酸等),酰基肉碱代谢,自噬和抗氧化物质代谢(葛根糖苷、黄豆黄素、二氢玉米素等)几个方面。综上,通过对硫辛酸最适添加量以及其作用的代谢组学机制进行分析,确定中华绒螯蟹幼蟹饲料中硫辛酸的最适添加量为1339.13-1574.09 mg/kg,代谢组学结果表明,硫辛酸的摄入显著影响了中华绒螯蟹机体对脂肪酸和氨基酸的代谢,且显著增加了饲料中抗氧化物质的吸收和沉淀,提高了机体的抗氧化能力。3.不同脂肪饲料中添加硫辛酸对中华绒螯蟹生长及生理的影响作为水产动物饲料中的三大营养物质之一,单位质量的脂肪能够为机体提供的能量是糖类和蛋白质的两倍,因此,若能够高效的利用饲料中的脂肪为机体提供能量,是节约饲料蛋白,减少环境污染的重要手段之一。本部分研究评估了不同脂肪含量(7%和13%)的饲料中,硫辛酸的不同添加量(700和1400 mg/kg)对中华绒螯蟹幼蟹生长表现,体成分,抗氧化能力,肝胰腺脂质分解代谢和脂肪酸组成的影响。8周后,结果显示,在两种饲料脂肪含量下,700和1400 mg/kg硫辛酸的摄入均能够显著的提高中华绒螯蟹幼蟹的增重和特定生长率,且体总脂和肝胰腺总脂含量随着硫辛酸添加剂量的升高而显著增加;摄入13%饲料脂肪的蟹肝体比显著高于摄入7%饲料脂肪的蟹肝体比。7%饲料脂肪含量下,肝胰腺es_TGL2和es_IL的表达量随着硫辛酸添加量的增加而上升,CPT-1的表达量在各个处理组间无显著差异;1400 mg/kg硫辛酸的添加显著的改善了由于肝胰腺脂质的大量堆积对机体造成的氧化损伤,此处理组具有较高的SOD和GSH-Px活力和较低的MDA含量;13%饲料脂肪含量中,由于肝胰腺中过量的脂肪蓄积,GSH-Px的活力被显著抑制,但T-AOC随着硫辛酸添加量的增加而升高。本部分研究结果表明,无论在哪种饲料脂肪含量下,硫辛酸的添加都能够提高中华绒螯蟹幼蟹的生长表现,并能够促进肝胰腺脂质的蓄积,同时,硫辛酸能够缓解由于肝胰腺脂质的过量蓄积对机体造成的氧化损伤,改善中华绒螯蟹幼蟹的健康状况。4.硫辛酸与脂肪源对中华绒螯蟹的交互影响及不同脂肪源下肝胰腺脂质组学分析饲料脂肪营养价值取决于脂肪的质量,而脂肪的性质取决于其脂肪酸成分,不同的脂肪酸组成和比例发挥不同的功能,因此,本部分研究内容以四种不同的植物油源,棕榈油(棕榈酸)、橄榄油(油酸)、红花籽油(亚油酸)和紫苏籽油(亚麻酸)为脂肪源,分别设置不添加或添加1400 mg/kg的硫辛酸,在8周养殖实验后,对中华绒螯蟹幼蟹生长表现、体成分、抗氧化能力、脂质分解代谢和肝胰腺的脂肪酸组成进行分析。结果显示,中华绒螯蟹幼蟹的增重率、特定生长率、肝体比和存活均未受到饲料脂肪源和硫辛酸的显著影响。中华绒螯蟹水分、蛋白质和灰分在各个处理组之间也均无显著性差异,在橄榄油和紫苏籽油处理组中,硫辛酸的添加显著的降低了蟹体成分总脂的含量,在添加硫辛酸的四种油源处理组中,棕榈油处理组中蟹体总脂含量显著的高于其他三种油源处理组。紫苏籽油处理组中,硫辛酸的添加对中华绒螯蟹肝胰腺抗氧化能力的影响最显著,添加硫辛酸后,肝胰腺中SOD,GSH-Px,T-AOC的活力和GSH的含量均显著的高于未添加硫辛酸组,同时,MDA的含量也高于对照组,硫辛酸的添加对其他三种油源处理组中华绒螯蟹肝胰腺抗氧化能力均无显著的影响。对甘油三酯分解基因表达分析,未添加硫辛酸的四种油源处理组中,紫苏籽油中es_TGL2,es_IL,es_DGL,es_CPT-1的基因表达量均低于其他三种油源,es_IL和es_CPT-1在橄榄油处理组中具有最高的基因表达;在棕榈油处理组中,硫辛酸的添加显著增加了es_TGL1的基因表达量,显著降低了es_DGL的基因表达量,在橄榄油处理组中,硫辛酸的添加显著的降低了es_TGL2和es_IL的基因表达量,在紫苏籽油处理组中,硫辛酸的添加显著的提高了es_IL和es_CPT1的基因表达量。饲料脂肪源显著的影响了中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺花生四烯酸和DHA的含量,极显著的影响了除EPA之外的主要脂肪酸含量,硫辛酸的添加显著的影响了C14:0,C16:0,C20:5n3,C22:6n3的含量,极显著的影响了C18:0,C18:1n9和C18:2n6的含量。饲料硫辛酸的添加显著的影响了∑PUFA的含量,极显著的影响了∑SAFA,∑MUFA和∑n-6的含量。目前为止,对于水生动物摄入不同的脂肪源后,机体对于脂肪酸的分配和组装的差别仍不清楚,因此,本部分采用新兴的脂质组学技术,分析了中华绒螯蟹摄入四种不同饲料脂肪源后,肝胰腺中不同类型的脂质中脂肪酸的装配情况,整理分析了甘油三酯(TG),磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的含量以及其脂肪酸的分配和百分含量。结果显示,橄榄油处理组肝胰腺的TG含量最低,紫苏籽油处理组中肝胰腺TG含量显著高于其他处理组;棕榈油和橄榄油处理组的PC含量无显著差异,但均显著高于红花籽油处理组,紫苏籽油处理组中PC含量显著低于其他三种油源处理组;PE的含量随着饲料主要脂肪酸饱和程度的增加而显著的下降。在TG的sn-1,3和sn-2位置中,脂肪酸的保留情况与摄入的主要脂肪酸一致,但sn-2位的C18:2含量在紫苏子油处理组最多;在TG的sn-1,3位,橄榄油处理组中多不饱和脂肪酸的含量显著低于其他三个油源处理组,红花籽油处理组中EPA和DHA的含量显著的高于其他处理组。在PC的sn-1位不含有C18:3,sn-2位不含有C18:0,饱和脂肪酸主要存在于sn-1位,不饱和脂肪酸主要存在于sn-2位。PE的sn-1位不存在C20:4,C20:5和C22:6三种脂肪酸,sn-2位不存在C18:0,sn-1位中主要结合的是C16:0和C18:0两种饱和脂肪酸,不饱和脂肪酸含量较少,而sn-2位主要结合的是C20:5和C22:6两种高不饱和脂肪酸,C16:0的含量非常少,PE的sn-1位和sn-2位置中主要脂肪酸的保留情况与机体摄入的主要脂肪酸类型一致。综上,不同饲料脂肪源下添加硫辛酸并未显著的改善中华绒螯蟹幼蟹的生长,但是在特定脂肪源处理下,能够提高机体的抗氧化能力;硫辛酸对机体甘油三酯分解代谢的影响与摄入的主要脂肪酸类型存在密切的关系,但硫辛酸的添加显著的影响了肝胰腺脂肪酸的组成。不同饲料脂肪源摄入后,中华绒螯蟹肝胰腺中TG和PE对于摄入的主要脂肪酸的保留情况较好,PC和PE的sn-1位主要结合饱和脂肪酸,而sn-2位主要结合不饱和脂肪酸,且并不是所有类型的脂肪酸都会结合在PC和PE的sn-1和sn-2位置上,本部分内容是甲壳动物中第一篇关于脂质组学的研究,丰富了甲壳动物脂肪酸代谢的基础知识,也为今后的相关研究提供了新的参考。