目的:本课题研究基于2013、2014年国家自然科学基金项目:穴位埋线经轴索反射对变应性鼻炎神经源性炎症的调控机制,和面部穴位埋线经“感觉神经肽----鼻黏膜树突状细胞”途径对变应性鼻炎鼻腔黏膜免疫系统的免疫调节机制的基础上,进行了深层次地探索和研究。我们前期研究已经证实,穴位埋线可以通过抢先抑制鼻腔黏膜内SP、VIP、CGRP等神经肽的释放来调控鼻黏膜神经源性炎症,从而缓解变应性鼻炎症状。然而穴位埋线如何最终实现对变应源性炎症调节的机制仍不清。为进一步探讨其作用机制,我们此次从体内外共三部分实验去深入研究。第一部分:从体内动物实验探索,提出神经免疫联动调节机制假说,以卵清蛋白（OVA）致敏法建立AR大鼠模型,观察穴位埋线对外周鼻黏膜神经免疫物质是否有干预作用?其中,外周鼻黏膜以SP为主的神经肽,在经穴位埋线干预下被抢先抑制其释放后,经穴位埋线是否也预先对鼻黏膜中肥大细胞（mast cell,MC）活性造成影响?MC活性的改变以上游膜表面受体TLR2、TLR4蛋白表达,下游胞内NF-kBp65蛋白的转录调节变化以及MC脱颗粒等为观察内容。第二部分:同样建立AR大鼠模型,观察穴位埋线对中枢海马区神经免疫物质是否也有干预作用?以海马组织内的SP、OX-42（小胶质细胞）、GFAP（星形胶质细胞）、TNF-α和IL-6的表达水平为观察内容。综合第一部分与第二部分的研究,观察外周鼻黏膜与中枢海马区神经免疫调节物质网络是否可能存在一个信息传入传出通路的“鼻-脑轴”发生机制。第三部分:从体外细胞实验探索,提出“穴位-鼻黏膜神经-树突状细胞”偶联假说,即穴位埋线通过迎香穴—三叉神经—蝶腭神经节—鼻黏膜神经径路与鼻黏膜中的树突状细胞（DC）偶联,通过抢先抑制鼻黏膜SP为主的感觉神经肽,从而直接影响DC的趋化、成熟、运动、吞噬、诱导等能力,进而以点带面,启动了对黏膜免疫系统的三道免疫防线的调节,最终减轻鼻黏膜炎症反应,缓解AR症状。本部分实验初步从体外进行了P物质对小鼠DC细胞系的干预与表达研究。方法:1.体内AR大鼠实验:60只SD大鼠随机分为6组:空白对照组,AR模型组,布地奈德治疗组,假埋线组,穴位埋线治疗1周组,穴位埋线治疗2周组。除空白对照组外,其余各组均采用OVA致敏方法制作AR动物模型。造模成功后,进行穴位埋线的两组均在迎香穴（LI20）埋入3-0羊肠线,分别经治疗1,2周进行阶段性观察;布地奈德组给予布地奈德滴鼻剂5ug/（kg·d）滴鼻,每日1次,共连续两周;假埋线组给予在迎香穴（LI20）假埋线动作,未植入羊肠线,相当于针刺作用;模型组维持卵清蛋白滴鼻,正常组给予生理盐水滴鼻。观察内容:1)造模及穴位埋线干预后的大鼠AR相关的行为学评分变化;2)HE染色下的各组鼻黏膜组织病理形态学改变;3)ELISA检测各组血清sIgE,IL-4和IFN-γ水平;4)免疫组织化学法检测各组鼻黏膜组织中神经肽SP,NF-kBp65蛋白表达水平;5)免疫荧光双染法检测各组TLR2、TLR4在肥大细胞膜表面的蛋白表达差异;6)Westernblot法（蛋白质免疫印迹）检测各组TLR2、TLR4在肥大细胞膜的蛋白表达差异;7)甲苯胺蓝染色法检测各组鼻黏膜组织中肥大细胞脱颗粒率的差异。2.体内AR大鼠实验:釆用方法1中同样的造模、分组及干预方法,在其基础上,观察以下内容:1)ELISA检测各组海马组织TNF-α和IL-6水平;2)免疫组织化学法检测各组海马组织中SP,GFAP和OX-42蛋白表达水平。3.体外小鼠细胞实验:1)对小鼠DC细胞系进行复苏、传代和冻存,鉴定培养的小鼠细胞为DC细胞。2)进行SP神经肽(10^-10 M—10^-4M浓度)对DC细胞12、24、48、72h的毒性研究。3)采用流式细胞分析术进行SP对小鼠DC细胞系表型CD40、CD80、CD86、CD11c分子的表达分析。4)采用荧光定量方法检测SP对小鼠DC细胞系TLR2和TLR4受体的表达。结果:1.穴位埋线对变应性鼻炎大鼠外周鼻黏膜神经免疫联动机制的研究（1）对大鼠AR相关的行为学评分的影响:与模型组和假埋线组相比,穴位埋线组与布地奈德组均能明显改善AR症状,具有明显统计学意义（P<0.01）。并且随穴位埋线周期的延长,埋线治疗第2周较第1周,改善AR症状更明显,具有明显统计学意义（P<0.01）。（2）光镜下鼻黏膜组织HE染色结果:模型组和假埋线组均显示,鼻黏膜上皮结构的完整性被破坏,纤毛上皮排列不规则,有不同程度的脱落、水肿和倒伏,以及伴有嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润。而穴位埋线治疗组和布地奈德组与模型组和假埋线组相比,炎症反应较轻。（3）ELISA检测结果显示:模型组与假埋线组的水平无明显差异（P>0.05）,结果均显示,血清sIgE及IL-4水平明显升高,IFN-r水平明显下降。而埋线治疗2周组与布地奈德组均能明显下调血清sIgE及IL-4水平（P<0.01）,上调IFN-r水平（P<0.05）。（4）免疫组织化学检测结果:在各组SP蛋白与NF-kBp65蛋白表达水平的比较中,模型组、假埋线组均显示明显升高,且组间无明显统计学差异（P>0.05）。与模型组和假埋线组相比,埋线治疗2周组与布地奈德组均下调,且具有明显统计学差异（P<0.01）。（5）免疫荧光双染检测:染色中TLR2显示绿光,TLR4显示红光,DAPI染核显示蓝色。在各组TLR2和TLR4蛋白表达水平的比较中,模型组与假埋线组均显示明显升高,且组间无明显统计差异（P>0.05）。埋线治疗2周组与布地奈德组均显示明显下调,且组间也显示无统计学意义（P>0.05）。但从数据走向趋势上,埋线治疗2周组下调TLR2蛋白更明显,布地奈德组下调TLR4蛋白更明显。（6）Western blotting分析结果:在各组TLR2和TLR4蛋白表达水平的比较中,假埋线组和模型组均显示明显升高,且两组之间无明显统计学差异（P>0.05）。埋线1周,埋线2周和布地奈德组三组均能抑制二者蛋白表达,且组间显示无明显统计学差异（P>0.05）。（7）甲苯胺蓝染色下的肥大细胞脱颗粒率情况:在各组肥大细胞脱颗粒率的比较中,假埋线组和模型组均显示明显升高,且两组之间无明显统计学差异（P>0.05）,埋线1周、埋线2周和布地奈德组均能抑制肥大细胞脱颗粒率,且三组组间显示无明显统计学差异（P>0.05）,埋线2周和布地奈德组明显低于模型组或假埋线组,且组间具有明显统计学差异（P<0.01）。2.穴位埋线对变应性鼻炎大鼠中枢海马区神经免疫调节机制的研究（1）ELISA检测结果显示:在各组海马组织TNF-α及IL-6水平比较中,模型组与假埋线组均显示明显升高,且两组无明显统计学差异（P>0.05）。与模型组、假埋线组相比较,埋线2周和布地奈德组均显示明显下降,具有明显统计学差异（P<0.01）。（2）免疫组织化学检测结果显示:在各组海马组织SP、GFAP和OX-42蛋白表达水平比较中,模型组与假埋线组均显示明显升高,且两组无明显统计学差异（P>0.05）。与模型组、假埋线组相比较,埋线2周显示明显下降,具有统计学差异（P<0.05）。3.P物质对小鼠DC细胞系的干预与表达研究（1）小鼠DC细胞经传代培养,在倒置光学显微镜下（100倍,200倍,400倍）观察细胞形态,充分证实该培养细胞为小鼠树突状细胞（DC细胞）。（2）不同浓度0.1nM(10^-10M)至100mM(10^-4M)的SP用DC细胞12、24、48、72h后均无明显毒性。（3）SP作用于DC细胞24小时后,在倒置光学显微镜下（100倍,200倍,400倍）观察细胞形态,充分证实SP作用24小时DC细胞形态无明显变化。（4）SP能有效刺激DC细胞的表达,主要是刺激CD86表面分子,在24小时对刺激CD40表面分子较低,而经过24小时到达48小时,刺激CD40表面分子作用能力较强。（5）不同浓度SP对DC细胞24小时和48小时作用均能够促进TLR2和TLR4受体的表达,且对TLR4受体促进作用强于TLR2受体作用,促进作用于时间和剂量呈现正相关。结论:1.穴位埋线通过抢先抑制SP的表达,进而可能抢先调节了鼻腔黏膜MC-TLR2/4-NF-kBp65炎症信号的传导,实现神经免疫联动调节,从而缓解AR症状。2.穴位埋线可下调AR大鼠海马区神经免疫物质（SP、OX-42、GFAP和TNF-a、IL-6）的表达,缓解AR大鼠的行为症状,综合外周鼻黏膜和中枢神经免疫内分泌网络调节,一方面为可能存在的“鼻-脑轴”学说提供初步理论依据,另一方面为前期临床观察循经取穴穴位埋线治疗AR的中枢边缘系统海马区效应特征提供科学实验依据,为进一步的研究指明了方向。3.采用CCK8方法检测DC细胞毒性、流式细胞仪检测其对DC细胞的CD40、CD80、CD86、CD11c的表达,荧光定量方法检测TLR2和TLR4受体的研究证实,SP在工作浓度范围内对细胞无毒性,且能有效刺激CD40、CD80、CD86、CD11c的表达,还能促进TLR2和TLR4受体的表达,且对TLR4受体促进作用强于TLR2受体作用,促进作用与时间和剂量呈现正相关。