家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)属于杆状病毒家族的α-杆状病毒属,是引起家蚕病害的主要病原。BmNPV在感染宿主细胞的过程中会产生两种遗传物质相同但形态结构各异的病毒粒子,即出芽型病毒粒子(BV)和包涵体衍生型病毒粒子(ODV)。ODV经口感染昆虫中肠引发原发性感染后,产生的BV随后感染其他细胞引起水平传播,最终导致宿主的全身性感染。GP64是BV的一种主要囊膜融合蛋白,在介导病毒感染和水平传播过程中发挥了关键作用。本研究旨在探究BV入侵宿主的分子机制,鉴定与BV结合的细胞表面蛋白,以及筛选宿主细胞中的GP64互作蛋白,从分子水平阐述杆状病毒出芽型病毒粒子BV入侵宿主细胞以及病毒主要囊膜蛋白GP64与宿主互作的分子机制。主要结论如下:1、BV病毒粒子入侵宿主细胞的机制利用内吞体酸化抑制剂在BV感染前处理家蚕BmN细胞,发现病毒增殖受到显著抑制,表明BV通过低pH介导的内吞作用途径进入BmN细胞。利用网格蛋白依赖的内吞作用途径抑制剂处理以及siRNA干扰网格蛋白重链CHC表达,结果表明网格蛋白介导的内吞作用途径参与了 BV入侵宿主细胞过程。此外,动力蛋白抑制剂处理实验证明了动力蛋白参与了 BV对宿主细胞的有效入侵。进一步通过siRNA干扰胞内囊泡运输和融合调控因子Rab蛋白,结果显示BV感染过程受到Rab5和Rab7调控,而Rabll不参与其中,表明早期和晚期内体的运输在BV病毒粒子入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。2、与BV结合的宿主表面蛋白筛选利用病毒覆盖蛋白结合实验,分离并纯化BV病毒粒子以及BmN细胞表面蛋白,并进行孵育。利用GP64抗体检测到3个明显蛋白条带,表明细胞表面存在与病毒相互作用的蛋白。进一步通过质谱分析,从3个阳性分离胶条中共鉴定到158种蛋白。GO分析表明这些蛋白涉及细胞组分、分子功能和生物过程。蛋白分子功能聚类结果显示,在这些鉴定到的蛋白中结合活性蛋白占比45%,转运活性蛋白占比4%,催化活性蛋白占比32%。以上数据为进一步鉴定与BV结合的宿主细胞膜蛋白受体打下了基础。3、BV关键囊膜融合蛋白GP64与宿主互作蛋白鉴定构建了家蚕BmN细胞酵母文库,以GP64作为诱饵蛋白进行酵母文库杂交分析,共筛选到8个与GP64结合的候选蛋白,分别为E3泛素连接酶SINA-like 10(E3 ubiquitin-protein ligase SINA-like 10)、RAN 结合蛋白 9(ran-binding protein 9)、磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶(phosphoribosylaminoimidazolecarboxylase)、卵裂和多腺苷化特异性因子 5(cleavage and polyadenylationspecific factor 5)、Abrupt-like 蛋白(protein abrupt-like)、NADH 泛醌氧化还原酶(NADH-ubiquinone oxidoreductase),以及两个未知蛋白 uncharacterized protein LOC101738779 和scaf49 2190774-2191531(-)。4、GP64互作蛋白SINAL10对病毒感染的影响对上述酵母双杂交鉴定的8个候选蛋白作进一步免疫共沉淀验证,发现E3泛素连接酶SINA-like 10(SINAL10)与GP64存在体外相互作用且在细胞内存在共定位。过表达和siRNA抑制实验表明SINAL10能够促进病毒在细胞内增殖,并在病毒的感染周期中发挥重要作用。本论文研究结果初步揭示了家蚕BmNPV BV入侵宿主细胞的途径,明确了该过程涉及网格蛋白介导的内吞作用,依赖于动力蛋白功能,并受到Rab5和Rab7蛋白调控,从分子水平上初步揭示了BV入侵宿主的机制。初步筛选了与病毒结合的细胞表面蛋白,并对其功能进行了注释分析。进一步利用酵母双杂交技术筛选到8个与病毒关键囊膜融合蛋白GP64相互作用的宿主靶标蛋白,并鉴定了其中一个蛋白SINAL10与GP64的互作关系,证明该蛋白对BV增殖具有促进作用。