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背景与目的:随着年龄的增加,机体各组织器官功能出现退行性改变,导致各种老年性疾病的发生。衰老已被认为是心血管疾病发生的一个重要的危险因素。内皮是最容易受衰老影响的组织之一,内皮细胞衰老是内皮衰老的基础。研究内皮细胞衰老机制并探索减缓内皮细胞衰老的新方法,对心血管疾病的防治具有重要意义。自由基学说认为氧化应激损伤是导致细胞衰老的主要原因之一。本研究采用过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导建立人脐静脉内皮细胞(human umbilicalvascular endothelial cells,HUVECs)衰老模型,旨在探讨硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)对HUVECs衰老的影响及其机制。方法与结果:1.采用酶消化法分离HUVECs,并进行原代培养,选取第二代稳定生长的细胞,倒置显微镜下观察,细胞呈短梭形,边界清晰,细胞经体外培养7天后,细胞融合呈现典型的铺路石样排列。采用免疫组织化学法检测HUVECs特异性标记物Ⅷ因子的表达以鉴定HUVECs及其纯度。2.采用25μmol/L H2O2诱导HUVECs建立细胞衰老模型,应用相差光镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞周期,衰老相关β-半乳糖苷酶(senescenceassociated acidic-β-galactosidase, SA-β-gal)染色检测衰老细胞率,蛋白免疫印迹(Western Blot)检测细胞周期调控因子p21的表达,从而鉴定HUVECs的衰老程度。结果表明,H2O2处理后,细胞体积增大,细胞边界不清,大小不均,呈衰老细胞样形态;SA-β-gal阳性细胞数达到11.2±1.06%(P<0.05);G0/G1期细胞比例增加25%;细胞周期蛋白p21的表达也明显上调,为正常细胞的1.5倍,且差异具有统计学意义(P<0.05)。3.选择不同浓度NaHS(0、15、30、60μmol/L)预先处理HUVECs48h后,再用H2O2诱导HUVECs衰老,采用SA-β-gal染色,流式细胞术检测细胞周期变化,MTT法检测细胞增殖率,划痕实验检测细胞迁移率,分析H2S对H2O2诱导的HUVECs衰老的影响。结果显示,与H2O2单独处理组比较,NaHS组SA-β-gal染色阳性细胞数随浓度的增高而减少(P<0.05),且NaHS浓度为60μmol/L时阳性细胞数最少(P<0.01);G0/G1期细胞比例降低16%,S期细胞比例增加14%(P<0.05);HUVECs的增殖迁移功能增加。4.采用Western Blot及Sirt1活性检测试剂盒测定H2S抗H2O2诱导HUVECs衰老中Sirt1蛋白表达及其活性,分析H2S对Sirt1的调节机制,结果表明,与H2O2相比,NaHS组Sirt1蛋白的表达没有明显改变,Sirt1的活性上调了19.21%。5.采用沉默信息调节因子1(silent information regulator1, Sirt1)抑制剂NAM与NaHS共同孵育HUVECs48h,再应用H2O2诱导HUVECs衰老,观察HUVECs SA-β-gal染色阳性细胞数的改变以及HUVECs增殖、迁移能力的变化,分析Sirt1被抑制后, H2S抗H2O2诱导HUVECs衰老的作用是否发生变化。结果显示,与NaHS组相比较,NAM+NaHS组SA-β-gal染色阳性细胞数增加了50%,并且HUVECs增殖,迁移功能明显降低。结论:H2S可拮抗H2O2诱导的HUVECs的衰老,其作用机制与上调Sirt1的活性有关。