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目的:山羊痘是由羊痘病毒属山羊痘病毒(GPV)引起的一种高度接触性传染病,呈地方性流行,对养羊业造成严重的危害和巨大经济损失。为了解山羊痘病毒贵州分离毒株与国内外毒株的序列关系和P32蛋白的抗原性,本研究开展了GPV P32基因的克隆、测序、序列分析、体外表达及表达蛋白的抗原性研究,期望获得利用该基因建立山羊痘基因工程疫苗及诊断方法的理论依据。方法:应用PCR方法扩增山羊痘病毒贵州分离株QL株、LD株和参考毒株Y株、B株P32基因,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-P32,将重组质粒转化到DH5α感受态细胞,经PCR和酶切初步鉴定为阳性的重组菌进行序列测定,并将所得序列与GenBank收录的国内GPV的P32基因进行序列分析;选择贵州代表毒株LD株P32基因的推导氨基酸序列为材料,应用计算机技术和生物学软件预测P32蛋白的跨膜结构、亲水性、抗原指数、柔韧性、表面可及性和二级结构,并综合评价P32蛋白可能存在的B细胞抗原表位;以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因,将基因片段克隆至原核表达载体pET-28a和毕赤酵母菌表达载体pPICZαA,构建重组表达载体,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导其表达,应用SDS-PAGE和Western-Blotting试验分析蛋白表达情况;通过Ni柱亲和层析和G-100层析技术对表达蛋白产物进行纯化,分别应用琼脂双扩散试验和免疫动物实验检测纯化蛋白的抗原性。结果:将GPV-QL、GPV-LD、GPV-Y和GPV-B毒株的P32基因序列分析显示,GPV贵州分离株之间核苷酸同源性高达99.9%,与国内其它GPV分离株的核苷酸同源性达到99.7%～100%,与国外GPV分离株核苷酸同源性达到99.5%～99.6%,表明P32基因高度保守;P32蛋白的跨膜结构、亲水性、抗原指数、柔韧性、表面可及性和二级结构分析结果显示,P32蛋白含有一个跨膜结构,肽段227-251区域的各种预测指数均高,推断该区域存在一个潜在的优势抗原表位。以pMD18-T-P32/LD质粒为模板,扩增P32基因并克隆至表达载体,构建原核重组表达载体和真核重组表达载体,转化至相应的宿主菌中进行诱导表达。结果表明,P32基因能通过原核表达载体pET-28a和毕赤酵母真核表达载体pPICZαA在各自宿主菌BL21(DE3)、X-33中获得表达,SDS-PAGE和Western-Blotting分析显示表达蛋白分子量分别为35.5KD和64KD;表达蛋白通过Ni柱亲和层析和SephadexG-100层析获得纯化,该纯化蛋白在琼脂扩散试验中与山羊痘阳性血清出现特异性的沉淀线,而与阴性血清不发生反应;采用纯化蛋白接种家兔制备免疫血清,该免疫血清使山羊痘病毒感染力减少50%的中和指数达到1:123.07。结论:通过对山羊痘病毒株P32基因的克隆测序及序列分析表明,P32基因序列同源性高度保守,P32蛋白含有一个跨膜结构,肽段227-251区域可能存在一个潜在的优势抗原表位,该分析结果为山羊痘病毒(GPV)P32基因工程疫苗的研究和体外表达产物的应用提供理论依据;分别应用原核表达系统和真核表达系统实现了P32基因的体外表达;琼脂扩散试验和动物试验结果表明纯化表达蛋白具有良好的抗原性;以上试验结果为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。