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背景激素性股骨头坏死目前发病机制仍不明确,近期研究认为与微血管内皮细胞损伤密切相关,但现有相关研究并没有使用骨微血管内皮细胞行激素性股骨头坏死基础研究。而且早期骨微血管内皮细胞的分离培养方法是取髂骨内骨髓游离内皮细胞用于血液系统疾病研究,不能真正地代表衬于骨骼系统血管内壁的内皮细胞。因此分离和培养股骨头骨微血管内皮细胞并使用该细胞研究激素性股骨头坏死更有意义。目的研究目的之一是探讨人股骨头骨微血管内皮细胞分离、培养方法,建立人股骨头微血管内皮细胞系,为后期实验研究提供细胞来源。目的之二是通过基因芯片对人股骨头骨微血管内皮细胞基因表达谱分析及实时定量PCR验证,探讨糖皮质激素对骨微血管内皮细胞损伤后发生的功能变化。方法为了达到第一个研究目的,研究Ⅰ中选择30例行髋关节置换患者切除的内部无病变的股骨头,男4例,女26例；年龄38-92岁,平均71.2岁。无菌条件下将股骨头内松质骨咬成碎骨粒,放入培养基。采用酶消化法,密度梯度离心法分离细胞；差速贴壁法,完全性内皮细胞培养基培养,内皮细胞生长因子以及肝素刺激内皮细胞生长来纯化细胞。倒置显微镜观察培养细胞的形态学特点及生长特性,并采用vWF、CD31、VE-cadherin、VCAM-1免疫荧光进行细胞鉴定。为了实现第二个研究目的,选择第三代BMECs进行实验。根据本实验室前期研究成果,使用0.1mg/ml和0.3mg/ml的含氢化可的松的培养基培养细胞,建立糖皮质激素骨微血管内皮细胞损伤模型。设正常对照组,对照组不加氢化可的松。加药后培养6、12、18、24小时倒置显微镜下观察。24小时后经Trizol法提取细胞样品的总RNA。使用晶芯@mRNA表达谱芯片对细胞损伤模型和对照组进行差异性转录本检测,选择内皮细胞与血管舒缩相关、反映凝血与纤溶以及与血管发生相关的基因行qPCR验证。结果研究Ⅰ中原代培养24h后相差显微镜下观察细胞数量与患者年龄呈正相关,年龄越大细胞越少。4-5d后细胞呈短梭形、多角形或“鹅卵石”状。7-10d后细胞生长密集,细胞融合呈漩涡状,接触抑制明显。vWF、CD31免疫荧光检测阳性率100%,VE-cadherin和VCAM-1抗体免疫荧光检测阳性率接近100%均证明了本实验培养的细胞是股骨头BMECs。研究Ⅱ中给予0.1mg/mL的氢化可的松干预的实验组BMECs与对照组比较呈收缩状态,体积变小,12-24小时见细胞出现生长抑制,状态差,细胞密度降低。0.3mg/mL的氢化可的松作用后可见大部分细胞凋亡。而对照组细胞则生长状态良好,渐趋融合。因此我们选择0.1mg/mL的氢化可的松作用24小时后的细胞进行mRNA芯片检测。mRNA表达谱芯片表达基因筛选结果发现实验组BMECs与对照组比较共有差异表达基因519个,其中337个基因上调,182个基因下调。其中内皮细胞与血管舒缩相关、反应凝血与纤溶以及与血管发生相关的基因如ICAM-1、ET-1受体、PAI-1、血管紧张素Ⅱ受体较对照组明显上调,eNOS、ET-1、PGI2合成酶、VEGF、PGE合成酶及PGE受体表达明显下调。对上述基因进行qPCR验证,结果与芯片结果一致。结论结论Ⅰ是本方法分离培养人股骨头骨微血管内皮细胞简单、稳定、有效、可重复性好,可获得纯度较高的股骨头骨微血管内皮细胞。结论Ⅱ是糖皮质激素促进了人股骨头骨微血管内皮细胞分泌缩血管因子、促凝血的因子及相关受体的表达,降低了舒张血管因子及相应受体的表达。