母源效应基因在卵子发生的过程中大量转录并积累在卵母细胞胞质中,在卵子发生、卵母细胞的成熟和植入前胚胎的发育中起到关键的作用。而在受精之后随着早期胚胎卵裂的进行,母源效应基因产物又迅速降解,促使胚胎由母体调控机制向合子基因组调控机制转变。对于母源效应基因的研究多见于小鼠这种模式动物中,而对于猪这种大型家畜的母源效应基因的了解很少,另外母源效应基因独特的表达模式的调控机理也鲜为人知。因此,发现和鉴定母源效应基因,了解其基因功能,探索其表达调控机理对了解卵母细胞生长及早期胚胎发育机制有重要指导意义,并对卵母细胞体外成熟,体细胞克隆以及转基因新品种培育等高端生物技术的改进和发展有重大参考价值。因此本研究选取了猪母源效应基因PADI6为研究对象,展开了对其表达模式、基因功能和调控机制的研究。所得结果如下所述:1.通过普通PCR和RACE技术成功克隆了全长2380bp的猪PADI6基因cDNA序列,其中包括76bp的5’非翻译区,228bp的3’非翻译区,开放阅读框为2076bp;并利用5’RACE和RT-PCR结合,鉴定出猪PADI6基因位于翻译起始位点上游-76bp的碱基G为主要的转录起始位点。2.通过对猪PADI6、MATER和NPM2三个母源效应基因的组织表达谱分析发现三个基因的表达都有很严格的组织特异性,主要在卵巢中表达,符合母源效应基因的表达特点;对三个基因在孤雌激活和体外受精两种方式产生的早期胚胎中的表达模式进行了分析,结果显示转录产物在GV期和MII期卵母细胞中有大量积累,但随着卵裂的进程迅速下降,直到桑椹胚和囊胚阶段则基本检测不出任何表达,证明三个基因都是以一种母源效应基因典型的方式受到调控;对PADI6基因在不同发育阶段卵巢中的表达模式分析表明PADI6基因在2月龄卵巢中的表达达到了最大值,2到4月龄之间随着卵巢的发育表达量迅速下降,在4到6月龄性成熟后达到一个相对稳定的表达水平。3.通过超表达实验表明,超表达PADI6基因能够上调组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2基因的表达水平,也能够促进DNA甲基化酶DNMT2基因的表达,此外还可以使处于G1期的细胞比例增加,而导致处在S期和G2期的细胞总数减少。4.成功克隆分离了1886bp(-1777/+109)的猪PADI6基因5’侧翼核苷酸序列,并通过对构建的5’端缺失载体的荧光活性分析鉴定出位于-85bp到+68bp之间的153bp的核心启动子;通过对核心启动子区的生物信息学分析发现该区存在两个Sp1转录因子结合位点,分别位于-56/-47bp和-11/-4bp,且-56/-47bp的Sp1结合位点在小鼠同源序列中高度保守。5.通过对两个预测的Sp1结合位点进行突变后构建启动子荧光载体,分析发现只有位于-56/-47bp的Sp1结合位点能够影响启动子的荧光活性;EMSA实验以及ChIP实验验证Sp1蛋白不但在体外可以与-56/-47bp位点结合,而且在体内水平同样能够结合;ChIP实验同样证明转录因子Sp3也能够在体内水平和-56/-47bp的Sp1结合位点结合。6.通过超表达转录因子Sp1或Sp3后发现不但能够增加PADI6基因的启动子荧光活性,而且可以促进PADI6基因的表达上调;通过特异siRNA片段干扰Sp1或Sp3后发现不仅能够降低PADI6基因的启动子活性,而且能够抑制PADI6基因的表达;通过Mithramycin A药物处理阻断了转录因子与DNA高GC位点的结合后发现PADI6基因的启动子荧光活性和表达量都会随着药物的浓度的增加而下降;通过对Sp1和Sp3在不同发育时期的卵巢中的表达模式进行分析,发现Sp1和Sp3与PADI6基因在卵巢发育过程中有着十分相似的表达模式。以上实验表明转录因子Sp1和Sp3能够通过和-56/-47bp位点结合来协同合作参与PADI6基因的表达。7.通过分别构建猪和小鼠3’UTR pmirGLO荧光载体,并与相应miRNA的mimics或者inhibitor共转,验证出miR-320能够降低PADI6基因3’UTR荧光载体的活性;通过对预测结合位点的定点突变实验确定了miR-320在PADI6基因3’UTR的结合位点;通过miR-320的mimics和inhibitor转染CHO细胞后发现miR-320能够抑制PADI6基因的蛋白表达水平。因此得出结论miR-320能够通过与PADI6基因的3’UTR的特定位点结合来抑制PADI6基因的表达。通过本研究我们对母源因子的产生与降解的分子机制有了更为深入的认识,这对进一步探索卵母细胞生长成熟以及早期胚胎的发育机理有重要参考价值。