论文部分内容阅读
香蕉是华南地区北运和出口的主要水果之一，经济价值很高，但香蕉属冷敏性水果，贮藏温度低于12℃时即发生冷害，其症状表现为:凹陷、褐变、果实硬化、失去风味及丧失成熟能力等。低温冷害导致果实抗病性降低和贮藏期缩短，严重影响果实出口和内销。硫氧还蛋白(Trx)是一类广泛存在于原核与真核生物体内的氧化还原调节蛋白。最近研究发现，Trx在植物生长发育和抗逆境胁迫中起重要作用。本文利用同源克隆和RACE技术从香蕉果实中克隆了硫氧还蛋白Trx基因，分析了香蕉硫氧还蛋白的结构，并对其进行原核表达、纯化和酶学性质研究，探讨了硫氧还蛋白基因Trx在香蕉果实冷害和耐冷诱导中表达特性，为控制香蕉果实冷害提供理论依据。主要研究结果如下:
1.采用同源克隆和RACE技术从香蕉果实中克隆了3个硫氧还蛋白Trx基因全长cDNA，分别命名为MaTrx6、MaTrx9和MaTrx12。其中，MaTrx6cDNA序列全长695bp，编码127个氨基酸，3’-非翻译区(3’-UTR)长246bp，5’-非翻译区(5’-UTR)长65bp;MaTrx9序列全长1168bp，编码272个氨基酸，3’-UTR长225bp，5’-UTR长124bp;MaTrx12序列全长1080bp，编码144个氨基酸，3’-UTR长355bp，5’-UTR长290bp。氨基酸同源性比对表明，MaTrx6与小麦TaTrx同源性最高为62％;MaTrx9和葡萄VvTrx同源性最高为71％;而MaTrx12与桃PpTRX同源性也仅为69％。系统进化树分析表明，MaTrx6与单子叶植物小麦TaTrxh、玉米ZmTrxh和水稻OsTrx等亲缘关系较近，而MaTrx9和MaTrx12则与木本双子叶植物桃PpTrx和柑桔CrTrx遗传距离相对较近。亚细胞定位预测表明，MaTrx6和MaTrx12定位于细胞质;MaTrx9定位于叶绿体。MaTrx6、MaTrx9和MaTrx12基因在香蕉的果皮、叶、花瓣、子房、根、茎中均有表达，且在根中表达最高，而在茎、叶中表达较低，在果皮中表达居中。
2.MaTrx6具有典型的活性催化位点CGPC，而MaTrx9和MaTrx12蛋白中活性催化位点分别突变为CAGC和CSPC。MaTrx6几乎具有典型的Trx蛋白所有保守氨基酸残基，不同的是在α1螺旋的N端苯丙氨酸残基缺失;MaTrx9蛋白部分保守氨基酸残基发生突变;Trx12蛋白有少部分保守氨基酸残基发生突变。蛋白质三级结构建模结果显示，MaTrx6具有典型的Trx蛋白结构，即由5个β折叠构成一个疏水核心，被4个α螺旋包绕形成一种结合紧密的球形蛋白，Trx催化中心CGPC模体位于α2螺旋的氨基端;MaTx9核心部分三级结构松散，呈现无规则状;MaTrx12三级结构虽不具备典型Trx球形构象，但其结构相对MaTrx9紧凑。这与我们蛋白质理化性质预测的结果相一致，即Marx6和MaTrx12蛋白较稳定，而MaTrx9蛋白不稳定。
3.在获得全长cDNA的基础上，构建融合表达载体pET28a-MaTrx12，转化大肠杆菌(Escherichiacoli)表达菌株BL21(DE3)进行原核表达，得到一个18.3kDa的融合蛋白;应用镍柱亲和层析的方法对该融合蛋白进行纯化，得到纯度较高的MaTrx12蛋白，该蛋白具有较强的活性，且具有较高的热稳定性。
4.低温胁迫明显诱导了MaTrx6和MaTrx12基因的表达，但MaTrx9基因在果实转入低温时表达受到显著抑制，随着低温时间的延长被诱导，表明不同种类的香蕉Trx基因对氧化胁迫的反应存在差异。香蕉果实经热水处理后在低温贮藏过程中MaTr6，MaTrx9和MaTrx12基因表达均明显下调;乙烯处理抑制了香蕉果实在冷藏过程中MaTrx6和MaTrx9基因的表达，但MaTrx12基因的表达被乙烯处理显著诱导;香蕉果实经乙烯受体抑制剂1-MCP处理后，这三个基因的表达水平基本不受诱导或抑制。