弯曲菌是世界范围内最常见的人兽共患食源性病原菌之一,常引发人类肠道疾病。在弯曲菌的流行传播中,家禽作为其最常见的宿主,发挥着重要的作用。为了应对家禽生产中的弯曲菌污染,已有多种抗菌制剂被用于防控研究。其中,噬菌体作为细菌病毒,能够特异性识别并裂解弯曲菌,有望成为新型的抗菌制剂。然而,噬菌体的宿主专噬特性通常会导致其裂解谱狭窄,因此需要对噬菌体进行筛选组合,形成噬菌体鸡尾酒组合,以满足应用需求。本研究首先对弯曲菌噬菌体进行了分离筛选并组合出噬菌体鸡尾酒,之后从定性研究、定量研究和分子流行病学研究的角度探究了家禽养殖与屠宰环节中弯曲菌的流行变化情况,并利用噬菌体进行了养殖环节弯曲菌的防控应用,为弯曲菌的防控提供新思路。一、弯曲菌噬菌体的分离及其鸡尾酒组合的筛选2017年9月至2018年6月,在江苏和山东等地采集鸡粪便样品495份,总计检测出180份弯曲菌噬菌体阳性样品,分离到弯曲菌噬菌体205株。分离结果表明,家禽市场样品的噬菌体阳性率(53.33%)显著高于养殖场(6.67%)。在噬菌体的筛选中,使用29株不同ST型、PFGE型的弯曲菌作为测试菌株初步筛选出24株噬菌体。之后,利用筛选出的噬菌体测定了养殖场229株空肠弯曲菌分离株与99结肠弯曲菌分离株的裂解谱,并根据裂解谱测定结果选出3株噬菌体组合成了噬菌体鸡尾酒。噬菌体裂解结果表明,对空肠弯曲菌分离株,54.17%的噬菌体裂解率在20-40%之间,所有噬菌体强裂解率均在0-40%之间;对结肠弯曲菌分离株,62.50%的噬菌体裂解率在60-100%之间,67.66%的噬菌体强裂解率在40-80%之间。根据裂解谱结果,选择噬菌体P81、P152和Pa6组合成噬菌体鸡尾酒,组合后对养殖场空肠弯曲菌的强裂解率和裂解率分别提高到41.05%和86.46%,对养殖场结肠弯曲菌的强裂解率和裂解率分别提高到77.78%和93.94%。二、家禽养殖屠宰环节弯曲菌的流行病学及其噬菌体应用研究2018年7月至2019年7月,于江苏淮安地区和山东枣庄地区进行了家禽屠宰场和养殖场的采样。共采集2家屠宰场和7家养殖场的鸡群样品总计2889份,包括养殖场鸡群肛拭样1170份,环境样430份,屠宰场鸡群宰前肛拭样245份,屠宰流程胴体擦拭样911份,环境样133份。定性研究结果表明,养殖屠宰环节共检出558份弯曲菌阳性样品,阳性率为19.38%,共分离空肠弯曲菌349株,结肠弯曲菌288株。养殖环节阳性率呈上升趋势,鸡群阳性率从21日龄的0%逐渐上升到42日龄的34.69%;屠宰环节,脱毛、净膛、消毒预冷、分割环节阳性率分别为21.6%、44.16%、22.42%和18.98%。不同养殖模式中,笼养模式阳性率(8.45%)显著低于平养模式(46.19%)。不同阳性率鸡群屠宰过程中阳性率差异明显,低阳性鸡群(4.00%)屠宰环节阳性率为1.2%,高阳性鸡群(46.00%)屠宰环节阳性率为74.00%。不同生产环节,弯曲菌分离株的优势种属分布不同,养殖环节空肠弯曲菌为优势种,占比69.30%,屠宰环节结肠弯曲菌为优势种,占比59.04%。定量研究结果表明,养殖环节鸡群弯曲菌定殖量呈上升趋势,定殖量从28日龄的9.27×105CFU/g上升到42日龄的5.10×106CFU/g。屠宰环节中,净膛环节载菌量为1.17×106 CFU/100cm2,显著高于脱毛环节(1.66×105 CFU/g,p<0.05)、消毒预冷(2.56×103 CFU/100cm2,p<0.001)和分割环节(3.98×103 CFU/100cm2,p<0.001)。大型屠宰场各环节的鸡胴体载菌量低于中型屠宰场(p<0.05)。养殖屠宰环节对部分鸡群进行跨环节追踪并对分离的弯曲菌测序后进行分子流行病学研究。结果表明,空肠弯曲菌分离株包含ST8089及三个新ST型,其中ST10242为优势ST型(占比65.00%);结肠弯曲菌分离株共六个ST型,其中ST 1586为优势ST型(占比70.00%)。同一只鸡在养殖环节和屠宰环节可以分离到相同ST型分离株,屠宰环节同一只鸡可以分离到不同ST型分离株,表明弯曲菌可以沿着生产环节进行传播,且屠宰过程中发生了交叉污染的现象。耐药基因检测结果表明,除一株结肠弯曲菌外所有分离株均含有4类以上耐药基因,且耐药基因分布呈现种属差异性。弯曲菌常见的8种毒力因子检测结果表明,空肠弯曲菌分离株均含有8种毒力基因(flaA,cadF,cdtA,cdtB,cdtC,iamA,ciaB,cheY),结肠弯曲菌分离株分别含有1-3种毒力基因。上述研究表明,养殖环节的弯曲菌污染可以通过生产链传递到屠宰环节,造成下游生产环节的严重污染,对养殖环节的弯曲菌进行防控具有重要意义。因此,基于噬菌体的分离筛选结果,后续探究了噬菌体鸡尾酒对家禽中弯曲菌的削减效果。体外实验中,噬菌体鸡尾酒24 h内可以使弯曲菌数量下降3 log值以上,且鸡尾酒组合的削减效果强于单一噬菌体的削减效果。体内实验中,定性结果表明,鸡群在攻毒弯曲菌2周半后阳性率达到100%,且接种噬菌体后实验组阳性率无显著下降。定量结果表明,饮水组和口服组噬菌体鸡尾酒的削减效果均在6-9天后达到最大,并于28天内逐渐减弱直至无明显削减效果。其中,鸡粪便中弯曲菌定殖量最大下降2.1 lg值;空肠、盲肠、结肠内容物中最大分别下降了1.51g值、2.41g值和21g值;空肠、盲肠和结肠组织中最大分别下降1.31g值、1.1 1g值和1.7 1g值。